Análise genética de hereditária transtirretina Ala97Ser relacionados a amiloidose
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para confirmar a presença da mutação de ponto para o diagnóstico de amiloidose hereditária transtirretina, usando Ala97Ser, a mutação mais comum endémica em Taiwan, por exemplo.
Abstract
Testes genéticos são o teste mais confiável para transtirretina hereditária relacionadas com amiloidose e deve ser realizado na maioria dos casos de amiloidose transtirretina (ATTR). ATTR é uma doença rara mas fatal com fenótipos heterogêneos; Portanto, o diagnóstico é por vezes adiado. Com o aumento da atenção e reconhecimento mais amplo sobre as manifestações iniciais de ATTR, bem como tratamentos emergentes, estudos de diagnósticos adequados, incluindo a transtirretina (TTR) genética teste, para confirmar os tipos e variantes de ATTR são, portanto fundamental para melhorar o prognóstico. Análises genéticas com métodos de reação em cadeia (PCR) polimerase confirmam a presença de mutações pontuais TTR muito mais rápido e mais seguro do que métodos convencionais tais como borrão do Sul. Aqui, demonstramos a confirmação genética da ATTR Ala97Ser mutação, a mutação mais comum endémica em Taiwan. O protocolo é composto por quatro etapas principais: coleta de amostra de sangue total, a extração de DNA, a análise genética de todos os quatro exões TTR com PCR e sequenciamento de DNA.
Introduction
Amiloidose transtirretina (TTR) (ATTR) é a forma mais comum de amiloidose sistêmica hereditária1e pode ser causada por uma mutação autossômica dominante herdada no gene transtirretina (TTR)2. Mutações de TTR desestabilizam a estrutura da proteína tetramérica e levam a sua dissociação em monômeros que reagrupa em amiloides2. Mais de 100 mutações de TTR amiloidogénicos foram relatados em todo o mundo1. Análises genéticas com métodos de reação em cadeia (PCR) polimerase confirmam a presença da mutação de ponto TTR e têm vantagens, incluindo evitar a manipulação de sondas radioactivamente etiquetadas em comparação com o borrão do Sul3. PCR é uma técnica rápida, fácil, barata e confiável que tem sido aplicada a inúmeros campos em ciências modernas4.
O diagnóstico precoce desta doença progressiva e fatal é um desafio, dada a sua heterogeneidade fenotípica. Com o aumento da atenção e reconhecimento mais amplo sobre as manifestações iniciais de ATTR, bem como as emergentes de tratamentos5, estudos de diagnóstico apropriados, incluindo teste genético de TTR, portanto, são criticamente fundamentais para melhorar o prognóstico. Além disso, diferentes mutações estão associados com penetrância diferente do traço, idade de início, os padrões de progressão, severidade da doença, a sobrevida mediana, eficácia do transplante de fígado, ou TTR estabilizadores2,6, e graus variáveis de envolvimento neurológico e cardiológico, que têm grandes implicações para o aconselhamento genético7,8,9. Além disso, um teste genético altamente preciso é a única ferramenta que diferencia os dois tipos distintos de ATTR: hereditária (mutante) e tipo selvagem (formulário não mutantes, amiloidose sistêmica senil, SSA)7. É imperativo para confirmar os tipos de ATTR, porque as terapias variam amplamente2. Portanto, há uma necessidade crescente para descrever o protocolo gradual do teste genético de TTR.
A abordagem molecular para detectar a mutação será ilustrada usando o Ala97Ser, a mutação mais comum endémica em Taiwan, por exemplo. Modificações na etapa de extração de DNA, reduzir a quantidade das três soluções usadas e produz uma quantidade suficiente de DNA. Neste protocolo, todos os quatro exões TTR foram analisados, enquanto regiões incluindo 5′ montante 3′ a jusante, os promotores, os intrões, e regiões untranslated (UTR) não foram sequenciadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há duas etapas críticas dentro do protocolo. Em primeiro lugar, a fim de ter o número suficiente de células brancas do sangue, um espécime de hemodiluted deve ser evitada11. Em segundo lugar, o uso de primers PCR apropriados é fundamental para obter resultados fiáveis12. Usamos a ferramenta web de Primer-BLAST para projetar as primeiras demão4,13; um mínimo de 40 pares de base em cada lado dos exões TTR qu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Srta Wu Shin-diversão pela ajuda nos experimentos. Este estudo foi suportado por uma concessão do Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) e IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
Materials
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
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