Генетический анализ наследственных Транстиретин Ala97Ser связанных амилоидоза
Summary
Здесь мы представляем протокол для подтверждения наличия Точечная мутация для диагностики наследственных Транстиретин амилоидоза, используя Ala97Ser, наиболее распространенных эндемических мутации в Тайване, в качестве примера.
Abstract
Генетическое тестирование является наиболее надежный тест для наследственных Транстиретин связанных амилоидоза и должна быть выполнена в большинстве случаев Транстиретин амилоидоз (ATTR). ATTR является редким, но роковой болезни с гетерогенными фенотипов; Следовательно диагноз иногда задерживается. С увеличением внимания и более широкого признания на ранних проявлений ATTR, а также новые процедуры, соответствующие диагностические исследования, включая Транстиретин (TTR) генетический тест, чтобы подтвердить типы и варианты ATTR поэтому фундаментальное значение для улучшения прогноза. Генетический анализ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) методов подтвердить наличие TTR точечные мутации гораздо быстрее и безопаснее, чем традиционные методы, такие как Южная помарка. Здесь мы демонстрируем Генетическое подтверждение ATTR Ala97Ser мутации, наиболее распространенных эндемических мутации в Тайване. Протокол включает четыре основных этапа: сбор образцов цельной крови, экстракции ДНК, генетический анализ всех четырех TTR экзонов с PCR и секвенирования ДНК.
Introduction
Амилоидоз Транстиретин (TTR) (ATTR) является наиболее распространенной формой наследственной амилоидоз системный1и может быть вызвана аутосомно-преимущественно унаследованные мутации в ген Транстиретин (TTR)2. TTR мутации дестабилизировать структуры tetrameric белков и привести к ее диссоциации в мономеров, которые собирает в амилоидных фибрилл2. Более чем 100 amyloidogenic TTR мутации были сообщалось во всем мире1. Генетический анализ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) методов подтвердить наличие TTR Точечная мутация и имеют преимущества, включая избежать обработки радиоактивно помечены зонды по сравнению с Южная помарка3. ПЦР является быстрый, простой, дешевый и надежный метод, который был применен к многочисленным полям в современных наук4.
Ранняя диагностика этого прогрессивного и смертельной болезнью является сложной задачей, учитывая его фенотипической неоднородности. С увеличением внимания и более широкого признания на ранних проявлений ATTR, а также новых методов лечения5, соответствующие диагностические исследования, включая TTR генетический тест поэтому критически важное значение для улучшить прогноз. Кроме того, различные мутации связаны с различными пенетрантностью черта, возраст начала, узоры прогрессии, тяжести заболевания, медиана выживаемости, эффективность трансплантации печени, или TTR стабилизаторы2,6, и переменной степени неврологических и кардиологических участия, которые имеют большие последствия для генетическое консультирование7,8,9. Кроме того, высокоточные генетический тест является единственным инструментом, который отличает два различных вида ATTR: наследственные (мутанты) и дикого типа (форма не мутант, сенильных системных амилоидоза, SSA)7. Важно подтвердить типы ATTR, потому что лечения различаются2. Таким образом существует растущее необходимость описания ступенчатой протокол TTR генетического теста.
Молекулярный подход для выявления мутации будут проиллюстрированы с помощью Ala97Ser, наиболее распространенных эндемических мутации в Тайване, в качестве примера. Изменения в шаге экстракции ДНК уменьшить количество три решения, используемые и дает достаточное количество ДНК. В этом протоколе были проанализированы все четыре TTR экзонов, а регионы, в том числе 5′ вверх по течению, 3′ вниз по течению, промоутеров, интронов, и непереведенные регионов (утр) не были упорядочены.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует два важных шага в рамках протокола. Во-первых для того чтобы иметь достаточное количество белых кровяных клеток, hemodiluted образец следует избегать11. Во-вторых использование соответствующих праймеры PCR имеет основополагающее значение для получения надежных резул?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотим поблагодарить Мисс Ву Син-удовольствие за ее помощь в экспериментах. Это исследование было поддержано грант от Чанг Gung программа медицинских исследований (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) и IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Тайвань.
Materials
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
Referências
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178 (2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. . Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19 (2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948 (2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall’Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
