Genetisk analys av ärftliga Transthyretin Ala97Ser med amyloidos
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bekräfta förekomsten av punktmutation för diagnos av ärftliga transtyretinamyloidos, med Ala97Ser, den vanligaste endemiska mutationen i Taiwan, som exempel.
Abstract
Genetisk testning är det mest tillförlitliga testet för ärftliga transthyretin relaterade amyloidos och bör utföras i de flesta fall av transtyretinamyloidos (ATTR). ATTR är en sällsynt men dödlig sjukdom med heterogena fenotyper; diagnosen försenas därför ibland. Med ökande uppmärksamhet och bredare erkännande på tidiga manifestationer av ATTR samt framväxande behandlingar, lämpliga diagnostiska studier, inklusive transthyretin (TTR) genetiska test, för att bekräfta typerna och varianter av ATTR är därför grundläggande att förbättra prognosen. Genetiska analyser med polymeras-kedjereaktion (PCR) metoder bekräfta förekomsten av TTR punktmutationer mycket snabbare och säkrare än konventionella metoder såsom södra blot. Häri, visar vi genetiska bekräftelse av ATTR Ala97Ser mutation, vanligaste endemiska mutationen i Taiwan. Protokollet består av fyra huvudsakliga steg: samla hela blodprovet, DNA-extraktion, genetisk analys av alla fyra TTR exoner med PCR, och DNA-sekvensering.
Introduction
Transthyretin (TTR) amyloidos (ATTR) är den vanligaste formen av ärftlig systemisk amyloidos1och kan orsakas av en autosomalt dominant ärftlig mutation i genen transthyretin (TTR)2. TTR mutationer destabilisera tetrameriskt proteinstruktur och leda till dess dissociation i monomerer som slår samman i amyloida fibriller2. Mer än 100 amyloidogenic TTR mutationer har rapporterats världen över1. Genetiska analyser med polymeras-kedjereaktion (PCR) metoder förekomsten av TTR punktmutation och har fördelar inklusive att undvika hantering av radioaktivt märkt sonder i jämförelse med södra blot3. PCR är en snabb, lätt, billig och pålitlig teknik som har använts på många fält i moderna vetenskaper4.
Tidig diagnos av denna progressiva och dödlig sjukdom är utmanande med tanke på dess fenotypiska heterogenitet. Med ökande uppmärksamhet och bredare erkännande på tidiga manifestationer av ATTR samt den framväxande behandlingar5, är lämpliga diagnostiska studier inklusive TTR genetiska test därför kritiskt grundläggande att förbättra prognosen. Dessutom olika mutationer är associerade med olika penetrans av drag, debutåldern, mönster av sjukdomens svårighetsgrad, median överlevnad, progression, effekten av levertransplantation eller TTR stabilisatorer2,6, och varierande grader av neurologiska och kardiologiskt engagemang, som har stor betydelse för genetisk rådgivning7,8,9. Dessutom en mycket exakt genetiska test är det enda verktyget som skiljer de två distinkta typerna av ATTR: ärftlig (mutant) och vildtyp (icke-mutanta formen, senil systemisk amyloidos, SSA)7. Det är viktigt att bekräfta typerna av ATTR, eftersom behandlingarna varierar kraftigt2. Därför finns det en ökande nödvändighet att beskriva stegvis protokollet av TTR genetiska testet.
Den molekylära metoden att upptäcka mutationen kommer att illustreras med Ala97Ser, den vanligaste endemiska mutationen i Taiwan, som exempel. Ändringar i DNA extraktion steg minska mängden av de tre lösningarna som används och ger en tillräcklig mängd DNA. I detta protokoll, alla fyra TTR exoner analyserades, medan regioner inklusive 5′ uppströms, 3′ nedströms, initiativtagare, introner, och oöversatta regioner (UTR) var inte sekvenserade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns två kritiska steg i protokollet. Först, för att ha tillräckligt antal vita blodkroppar, ett hemodiluted exemplar bör undvikas11. Andra, användning av lämplig PCR primers är grundläggande för att få tillförlitliga resultat12. Vi använde Primer-BLAST webbverktyg för att designa de primers4,13; minst 40 baspar på varje sida av de fyra TTR exonerna bör omfattas. Vi kör även BLAST på NCBI att…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Miss Shin-kul Wu för hennes hjälp i experimenten. Denna studie stöddes av ett bidrag från Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) och IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
Materials
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
Referências
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178 (2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. . Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19 (2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948 (2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall’Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
