Analyse de AtHIRD11 désordre intrinsèque et la liaison vers les Ions métalliques par électrophorèse capillaire et l’électrophorèse capillaire affinité
Summary
Ce protocole combine la caractérisation d’un échantillon de protéines par électrophorèse capillaire et une projection de liaison rapide avec les ligands chargés par électrophorèse capillaire en affinité. Il est recommandé pour les protéines avec une structure souple, comme les protéines intrinsèquement désordonnées, afin de déterminer les différences dans la liaison des différents conformères.
Abstract
Les plantes sont fortement dépendantes de leur environnement. Pour s’adapter à des changements stressants (par exemple, la sécheresse et à une salinité élevée), les plantes supérieures évoluent classes de protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) pour réduire le stress oxydatif et osmotique. Cet article utilise une combinaison de l’électrophorèse capillaire (CGE) et de la mobilité Maj affinité électrophorèse (ACE) pour décrire le comportement de liaison de différents conformères de l’IDP AtHIRD11 d’Arabidopsis thaliana. CGE est utilisé pour confirmer la pureté de AtHIRD11 et d’exclure les fragments, modifications post-traductionnelles et autres impuretés comme raisons de modèles complexes de pointe. Dans cette partie de l’expérience, les différents exemples de composants sont séparés par un gel visqueux à l’intérieur d’un tube capillaire par leurs différentes masses et détectés par un détecteur à barrettes de diodes. Par la suite, le comportement de liaison de l’échantillon vers différents ions métalliques est étudié par l’ACE. Dans ce cas, le ligand est ajouté à la solution tampon et le décalage dans le temps de migration est mesuré afin de déterminer si un événement de liaison a eu lieu ou non. Un des avantages de l’utilisation de la combinaison de la CGE et ACE pour déterminer le comportement de liaison d’un PCI est la possibilité d’automatiser l’électrophorèse de gel et l’essai de liaison. En outre, CGE indique une limite inférieure de détection que l’électrophorèse de gel classique et ACE est en mesure de déterminer le mode de liaison d’un ligand d’une manière rapide. En outre, ACE peut également être appliqué à d’autres espèces chargées que les ions métalliques. Cependant, l’utilisation de cette méthode pour les expériences de liaison est limitée dans sa capacité à déterminer le nombre de sites de liaison. Néanmoins, la combinaison de la CGE et ACE peut être adaptée pour caractériser le comportement de liaison de n’importe quel échantillon de protéines vers nombreux ligands chargés.
Introduction
Les plantes sont plus dépendantes de leur environnement que beaucoup d’autres formes de vie. Étant donné que les plantes ne peuvent pas se déplacer à d’autres endroits, ils doivent s’adapter à des changements dans leur environnement (p. ex., sécheresse, froides et hautes concentrations salines). Par conséquent, plantes supérieures développé des protéines de stress spécialisés comme les alignements, qui remplissent des tâches multiples afin de réduire le stress cellulaire lié à une salinité élevée. Ces protéines se lient l’eau et des ions à l’intérieur des cellules, réduire le stress oxydatif en liant Cu2 +-ions et d’interagir avec les phospholipides ainsi que les cytosquelettes. En outre, liaison Zn2 +-ions permet ces protéines d’agir comme des facteurs de transcription. Leur capacité à fixer Ca2 +-ions après phosphorylation a été également rapporté1.
Le comportement multifonctionnel de ces protéines est lié à l’absence de résidus d’acides aminés hydrophobes. Par conséquent, ils n’ont pas toutes les interactions hydrophobes à l’intérieur de la chaîne peptidique et aussi une structure restreinte. Toutefois, étant donné que ces protéines n’ont pas une structure restrictive, ils peuvent occuper différents conformères dans les mêmes conditions. Donc, ils peuvent mieux décrits comme un ensemble de structures plutôt que comme une seule conformation. Les protéines possédant ces propriétés sont connues comme intrinsèquement désordonnées des protéines (PDI) et sont un concept largement utilisé pour les protéines de stress et de la diaphonie entre les différentes voies dans les cellules eucaryotes2.
Un de ces déplacés liés au stress est AtHIRD11. C’est un des déplacés de sécheresse fortement exprimés la plupart de Arabidopsis thaliana. Par conséquent, les conformères différents peuvent être séparées par leur rayon effectif pour charger le rapport et électrophorèse capillaire (EC) a été utilisé pour complément d’enquête. Des expériences antérieures de ACE a démontré les interactions entre les AtHIRD11 et les ions de métaux de transition tels que Cu2 +– Zn2 +-, Co2 +et Ni2 +-ions. Les résultats détaillés se trouvent dans le Hara et al. 3 et Nachbar et al. 4.
La méthode ACE qui sera utilisée ici est issue de nos plus tôt les œuvres publiées6. Toutefois, l’ajout de l’acétanilide de marqueur du folklore à l’échantillon de protéines n’est pas adapté. AtHIRD11 montre motifs pic large et ajouter le marqueur du folklore à l’échantillon serait dissimuler deux pics. Par conséquent, le marqueur est utilisé dans un run séparé. Avant que le comportement de liaison est examiné, il est confirmé que les pics trouvées au cours d’expériences précédentes proviennent de différents conformères. Ainsi, CGE est utilisé pour distinguer entre les conformères de protéine, le poteau-de translation modifiées protéine et impuretés, telles que des fragments de AtHIRD11, par leurs masses différentes. Ensuite, le comportement de liaison de l’échantillon AtHIRD11 caractérisée vers divers différents ions métalliques est étudiée.
Le but de cet article est de décrire un dispositif expérimental de distinguer entre un IDP et autres composants d’un échantillon afin d’évaluer les différences dans le comportement de liaison de différents conformères.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour toutes les expériences de CE, la préparation du capillaire est une étape cruciale. Puisque c’est un tube de verre de petit diamètre, il peut facilement se casser dans les endroits où le revêtement est supprimé lorsqu’il est contrôlé. L’installation du capillaire dans l’instrument devrait être faite très soigneusement.
Les étapes critiques liés à l’utilisation de la méthode ACE principalement concernent le montage expérimental. Une autre étape cruciale consiste ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions remercier Masakuza Hara (Research Institute of Green Science et technologie, Université de Shizuoka, Japon) pour fournir les échantillons de protéine AtHIRD11.
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
Referências
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