AtHIRD11 本質的な障害とキャピラリー電気泳動と親和性キャピラリー電気泳動による金属イオンへの結合の解析
Summary
このプロトコルは、アフィニティ キャピラリー電気泳動キャピラリー電気泳動と荷電配位子の高速バインド スクリーニングによる蛋白質のサンプルの特性を兼ね備えています。天然変性タンパク質などの柔軟な構造を持つタンパク質は、異なる conformers のバインドの違いを決定するそれをお勧めします。
Abstract
植物は自分の環境に強く依存しています。ストレスの変化 (例えば干ばつ、高塩分) に調整するために高等植物は進化酸化および浸透圧ストレスを軽減する天然変性タンパク質 (IDPs) のクラスです。この記事は、シロイヌナズナから IDP AtHIRD11 の異なる conformers のバインドの動作を記述するために毛管電気泳動 (CGE) と移動性シフト アフィニ ティー電気泳動法 (ACE) の組み合わせを使用します。CGE は、AtHIRD11 の純度を確認する、複雑なピーク パターンの理由として断片、翻訳後修飾、および他の不純物を除外するために使用されます。この実験では、別のサンプル コンポーネントが質量の違いにより毛細血管内の粘性ゲルで区切られ、ダイオード アレイ検出器で検出されました。その後、エースで様々 な金属イオンへのサンプルのバインディング動作を調べた.この場合、リガンドが緩衝液に追加され、バインディング イベントが発生したかどうかを決定するために移動の時間にシフトを測定します。IDP のバインディング動作を決定する CGE とエースの組み合わせを使用する利点の 1 つはゲルの電気泳動および結合の試金を自動化する可能性です。なお、CGE は、古典的なゲル電気泳動法よりも検出下限値を示しています、エースは高速な配位子を結合の方法を判断することができます。さらに、エースは、金属イオンよりも他の荷電種にも適用できます。ただし、実験をバインドするこのメソッドを使用は、結合サイトの数を決定する能力に制限されます。それにもかかわらず、CGE とエースの組み合わせ多数荷電配位子に向けて蛋白質のサンプルのバインドの動作を特徴付けるために合わせることができます。
Introduction
植物は他の多くの生命よりも自分の環境に依存しています。植物は、他の場所に移動できません、ので彼らは (例えば干ばつ、寒さと高い塩濃度)、環境の変化に慣れる必要があります。その結果、高等植物は、高塩分に関連する細胞のストレスを軽減するマニホールドのタスクを達成する dehydrins のような特殊なストレス蛋白質を開発しました。これらの蛋白質は細胞内の水とイオンのバインド、バインド Cu2 +による酸化ストレスを軽減-イオン、リン脂質と細胞骨格との対話します。また、バインド Zn2 +のイオンにより、転写因子として機能するこれらの蛋白質。Ca2 +結合する機能-イオン リン酸化もされて後報告1。
多機能動作これらの蛋白質の疎水性アミノ酸残基の不在に関連しています。その結果、彼らはペプチド鎖とも拘束された構造内の任意の疎水性相互作用を欠いています。しかし、これらのタンパク質は、制限の厳しい構造を欠いている、ので彼らは同じ条件下で異なるコンフォーマを占有できます。したがって、彼らを記述できます最高単一構造ではなく構造のアンサンブルとして。これらのプロパティが付いている蛋白質は、ストレス蛋白質と真核細胞の2で異なる経路間のクロストークのため広く使われている概念は、本質的に無秩序なタンパク質 (IDPs) として知られています。
これらのストレス関連国内避難民の 1 つは、AtHIRD11 です。シロイヌナズナのほとんど非常に干ばつ表明した国内避難民の一つです。したがって、比を充電する、有効半径によって異なるコンフォーマを分けることができ、キャピラリー電気泳動 (CE) は、さらに調査のために使用されています。以前エース実験実証 AtHIRD11 と Cu2 +-、Zn2 +-、Co2 +、および Ni2 +などの遷移金属イオンの相互作用-イオン。原らの詳細な結果を見つけることができます。3ノーランゲルシリコーンナックバーら4。
ここで使用されるエース メソッドは、私たちの前の出版された作品6に基づいています。ただし、蛋白質のサンプルに EOF マーカー アセトアニリドの添加は適していません。AtHIRD11 はブロードなピーク パターンを示し、サンプルに EOF マーカーを追加する 2 つのピークを隠すでしょう。したがって、マーカーは、別々 の実行で使用されます。バインドの動作を検討する前に、前の実験中に検出されたピークは、異なるコンフォーマからことを確認しました。したがって、CGE タンパク質コンフォーマを区別するために使用、翻訳後修飾タンパク質と質量の違いにより、AtHIRD11 のかけらなどの不純物。その後、様々 な異なる金属イオンへの特徴付けられる AtHIRD11 サンプルのバインディング動作を検討しました。
この資料の目的は、異なる conformers の結合挙動の違いを評価するために IDP とサンプルの他のコンポーネントと区別するために実験装置を記述するためです。
Protocol
Representative Results
Discussion
すべての CE 実験用毛細血管の準備は重要なステップです。直径の小さいガラス管なのでそれは簡単にそれが処理されているときにコーティングを除去するスポットで破ることができます。楽器に毛細血管のインストールは非常に慎重にされるべきであります。
主にエース メソッドを使用する重要な手順は、実験のセットアップに適用されます。もう一つの重要なステッ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AtHIRD11 蛋白質のサンプルを提供するため Masakuza 原 (グリーン科学の研究所、静岡大学技術) をありがとう心より感謝いたします。
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
Referências
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