Formação de biofilme oral em diferentes materiais para implantes dentários
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a formação de biofilme oral em titânio e zircônio materiais para pilares de prótese dentária, incluindo a análise de viabilidade de células bacterianas e características morfológicas. Um modelo in situ associado com técnicas de microscopia poderoso é usado para a análise do biofilme oral.
Abstract
Implantes dentários e seus componentes protéticos são propensos a colonização bacteriana e formação de biofilmes. O uso de materiais que fornece baixa adesão microbiana pode reduzir a prevalência e a progressão das doenças peri-implante. Tendo em conta o ambiente oral complexidade e oral biofilme heterogeneidade, microscopia, são necessárias técnicas que pode permitir uma análise de biofilme das superfícies dos dentes e materiais dentários. Este artigo descreve uma série de protocolos implementados para comparar a formação de biofilme oral em titânio e materiais cerâmicos para pilares protéticos, bem como os métodos envolvidos em análises de biofilmes oral a nível morfológico e celular. O modelo in situ para avaliar a formação de biofilme oral em titânio e zircônio materiais para pilares de prótese dentária, conforme descrito neste estudo fornece uma boa conservação de biofilme a 48 h, mostrando assim a adequação metodológica. Microscopia do multiphoton permite a análise de um representante da área do biofilme formado sobre os materiais de teste. Além disso, o uso de fluorophores e o processamento das imagens usando microscopia do multiphoton permite a análise da viabilidade bacteriana em uma população muito heterogénea de microorganismos. A preparação de espécimes biológicos para microscopia eletrônica promove a preservação estrutural do biofilme, imagens com boa resolução e sem artefatos.
Introduction
Biofilmes bacterianos são complexas, funcionalmente e estruturalmente organizaram comunidades microbianas, caracterizam por uma diversidade de espécies microbianas que sintetizam uma matriz extracelular, biologicamente ativo polímero1,2. A aderência bacteriana às superfícies bióticas ou abióticas é precedida por uma formação da película adquirida, composta principalmente de glicoproteínas salivares1,3,4. Fracas físico-químicas interações entre os microrganismos e o pellicle são inicialmente estabelecidas e seguidas por interações mais fortes entre adesinas bacterianas e receptores de glicoproteína da película adquirida. Diversidade microbiana aumenta gradualmente através do coaggregation de colonizadores secundários aos receptores das bactérias já anexados, formando uma comunidade terminousua1,3,4, 5.
Homeostase da microbiota oral e sua relação simbiótica com o host é importante na manutenção da saúde bucal. A disbiose dentro biofilme oral pode aumentar o risco para o desenvolvimento da cárie e doença periodontal2,5. Estudos clínicos demonstram uma relação de causa-efeito entre o acúmulo de biofilme sobre dentes ou implantes dentários e o desenvolvimento de gengivite ou peri-implante mucosite6,7. A progressão do processo inflamatório leva à peri-implantite e a consequente perda do implante8.
Implantes dentários e seus componentes protéticos são propensos a colonização bacteriana e formação de biofilme9. O uso de materiais com uma composição química e a topografia da superfície que fornece baixa adesão microbiana pode reduzir a prevalência e progressão de doenças de peri-implante9,10. O titânio é o material mais utilizado para a fabricação de pilares protéticos para implantes; no entanto, materiais cerâmicos foram introduzidos recentemente e estão ganhando popularidade como uma alternativa ao titânio devido a suas propriedades estéticas e biocompatibilidade11,12. Também importante, os materiais cerâmicos têm sido associados com um potencial supostamente reduzido para aderir aos microrganismos, principalmente devido à sua rugosidade da superfície, molhabilidade e energia de superfície livre10,13.
Estudos in vitro têm contribuído para avanços significativos na compreensão da adesão microbiana a Pilar protético superfícies9,14,15,16,17. No entanto, o ambiente dinâmico da cavidade oral, caracterizada pela sua variação de temperatura e pH e disponibilidade de nutrientes, bem como pela presença de forças de cisalhamento, não é reproduzível em vitro protocolos experimentais18, 19. Para superar este problema, uma alternativa é o uso de modelos em situ da formação de biofilme, que vantajosamente preserva sua estrutura tridimensional por ex vivo análise10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
A análise da estrutura complexa do biofilme formado em substratos orais requer o uso de técnicas de microscopia capazes de exibir matéria densa opticamente25. Microscopia eletrônica de varredura do laser do multiphoton é uma opção moderna para análise estrutural de biofilme26. É caracterizada pelo uso de óptica não-linear com uma fonte de iluminação perto do comprimento de onda infravermelho, pulsada femtoseconds27. Este método é indicado para a aquisição de imagens de autofluorescência marcados por fluorophores, além de imagens geradas por sinais ópticos não-lineares derivados de um fenômeno conhecido como segunda geração harmônica ou materiais. Entre as vantagens da microscopia do multiphoton é a profundidade da imagem grande obtida com mínima célula danos causados pela intensidade da luz da excitação27.
Para uma análise de viabilidade de biofilme em superfícies abióticas por microscopia do multiphoton, o uso de fluorescente ácido nucleico tinge-se com diferentes características espectrais e uma capacidade de penetração nas células bacterianas é necessário28. Fluorophores SYTO9 (verde-fluorescente) e iodeto de propidium (vermelho-fluorescente) podem ser usados para uma diferenciação visual entre bactérias vivas e mortas28,29,30. Iodeto de propidium penetra apenas bactérias com membranas danificadas, enquanto SYTO9 entra em células bacterianas, com uma membrana intacta e comprometida. Quando ambos os corantes estão presentes dentro de uma célula, iodeto de propidium tem uma maior afinidade para os ácidos nucleicos e desloca SYTO9, marcando-o vermelho28,30.
Tendo em conta o ambiente oral complexidade e oral biofilme heterogeneidade, microscopia, são necessárias técnicas que pode permitir a análise de biofilme das superfícies dos dentes e materiais dentários. Este artigo descreve uma série de protocolos implementados para comparar a formação de biofilme oral em titânio e materiais cerâmicos para pilares protéticos, bem como os métodos envolvidos em análises de biofilmes oral a nível morfológico e celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito neste estudo foi desenvolvido para avaliar a formação de biofilme em titânio e zircônio materiais para pilares protéticos, incluindo a análise de viabilidade celular bacteriana e características morfológicas. Para realizar isso, foi desenhado um modelo in situ de formação de biofilmes, constituído por um dispositivo intraoral capaz de acomodar amostras dos materiais teste e mantê-los expostos ao ambiente oral dinâmico por 48 h. O dispositivo foi considerado confortável e fácil…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores graças a José Augusto Maulin do laboratório multiusuário de microscopia (Faculdade de medicina de Ribeirão Preto) pela ajuda generosa com o EDS e SEM análises e Hermano Teixeira Machado, por sua generosa assistência técnica na edição de vídeo.
Materials
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors – X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
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