Visualisering av bakterieflora i Tick Guts av hele-mount In Situ hybridisering
Summary
Her presenterer vi en protokoll for romlig og timelig vurdere tilstedeværelsen av levedyktig bakterieflora i kryss guts med en modifisert hele-mount i situ hybridisering tilnærming.
Abstract
Infeksjonssykdommer overføres av leddyr vektorer fortsatt utgjør en betydelig trussel mot helse over hele verden. Patogen som forårsaker disse sykdommene, finnes ikke i isolasjon når de kolonisere vektoren; snarere delta de sannsynlig i samhandling med bosatt mikroorganismer i tarmen lumen. Vector bakterieflora har vist seg for å spille en viktig rolle i patogen overføring for flere vektor-sykdommer. Om bosatt bakterier i tarmen av Ixodes scapularis flåtten, vektoren for flere human patogener inkludert Borrelia burgdorferi, påvirke tick overføring av patogener er ikke bestemt. Vi krever metoder for å karakterisere sammensetningen av bakterier assosiert med tick tarmen til rette for en bedre forståelse av potensielle interspecies interaksjoner i kryss tarmen. Bruker hele-mount i situ kan hybridisering visualisere RNA transkripsjoner forbundet med bestemt bakterie-art for innsamling av kvalitative data om overflod og distribusjon av bakterieflora i intakt vev. Denne teknikken kan brukes til å undersøke endringer i tarmen bakterieflora miljøet i løpet av tick fôring og kan også brukes til å analysere uttrykk for tick gener. Farging av hele tick guts gir informasjon om brutto romlige fordelingen av målet RNA i vevet uten behov for 3-dimensjonal modell og er mindre påvirket av miljøforurensning, som ofte forundrer sekvensering-basert metoder brukes ofte til å studere komplekse mikrobielle samfunn. Total, denne teknikken er et verdifullt verktøy som kan brukes til å bedre forstå vektor-patogen-bakterieflora interaksjoner og deres rolle i sykdommer overføring.
Introduction
Mennesker og husdyr patogener som overføres av leddyr vektorer finnes over hele verden og står for omtrent 20% av infeksjonssykdommer globalt1, men effektive og trygge vaksiner mot de fleste av disse patogener er ikke tilgjengelig. Vår forståelse av den viktige rollen av commensal, symbiotisk og sykdomsfremkallende mikroorganismer, kollektivt kjent som microbiome2, i modulerende og forme helsen til nesten alle Metazoer3 utvider. Nå er det klart at leddyr vektorer av patogener også havn tarmen bakterieflora og disse vektor-assosiert bakterieflora har blitt vist å påvirke ulike vektor-patogener4,5. Leddyr microbiome består av eubacteria, archaea, virus og eukaryotic mikrober som protozoer og nematoder sopp6. Men har dominerende fokus vært på eubacteria skyldes, delvis til tilgjengeligheten av markør gener og referanse databaser til å identifisere bestemte bakteriell medlemmer.
Med fokus på Ixodes scapularis, tick vektoren for flere human patogener inkludert Borrelia burgdorferi7, det forårsaker agenten av Lyme sykdom, optimalisering av en mikrobiell visualisering teknikk var rettet mot forbedre vår forståelse av tick tarmen bakterieflora i sammenheng med vektor-patogen interaksjoner. Flere spørsmål gjenstår å bli besvart i feltet tick microbiome. Tarmen er stedet for det første utvidede møtet mellom haken og innkommende patogen i sammenheng med vannrett overførte patogener; Derfor vil forståelsen av vektor tarmen bakterieflora i modulerende vektor-patogen interaksjoner avdekke meningsfull innblikk. Flått har en unik modus blod måltid fordøyelsen, hvor behandlingen av blod måltid komponenter tar sted intracellulært8. Gut lumen tilsynelatende fungerer som et fartøy som skal inneholde blod måltid som tick feedene, og næringsstoffer fordøyelse og assimilering følge gjennom flere dager fôring og fortsette etter repletion. Patogener kjøpt av flåtten under mating angi gut lumen sammen med bloodmeal og dermed lumen blir en hovedwebområdet av interaksjon mellom aksemerker, patogen og bosatt bakterieflora. Som fordøyelsen fortsetter gjennom repletion og Ixodid sjekke molting, gjennomgår tarmen strukturelle og funksjonelle endringer9. Sammensetning og romlig organisering av gut bakterier er også sannsynlig å variere sammen med skiftende gut miljøet. Derfor er det viktig å forstå arkitektur bosatt bakterier i tarmen tick å forstå samspillet mellom aksemerker, patogen og tarmen bakterieflora.
Molekylær teknikker å beskrive vert-assosiert bakterieflora rutinemessig benytte høy gjennomstrømming parallelle sekvenser strategier10 for å forsterke og sekvens bakteriell 16S ribosomal DNA (rDNA). Disse sekvensering strategier omgå behovet for å få axenic kulturer av spesifikke bakterier og gi en detaljert beskrivelse av alle bakteriell medlemmer representert i utvalget. Likevel er slike strategier forvirret av det manglende evne å skille miljømessige forurensing fra bona fide beboere. Videre når vurdere utvalgene, for eksempel flått, som er små i størrelse og dermed inneholder lav bakterieflora-spesifikke DNA gir, sannsynligheten av forsterkning av miljøgifter er økt11 og gir tvetydig tolkningen av Microbiome komposisjon. Funksjonell karakteristikk i forbindelse med visualisering av spesifikke levedyktig bakterier vil derfor være avgjørende for å definere og skjelne microbiome av flåtten timelig og romlig. Mot dette målet tok vi fordel av hele-mount RNA i situ hybridization. Denne teknikken brukes rutinemessig å vurdere genet uttrykk mønstre i organer og embryo12,13,14 og lar semiquantitative analyse av uttrykk over hele utvalget av interesse. Dette er forskjellig fra tradisjonell i situ hybridisering teknikker som utnytter vev deler og krever ofte omfattende analyse av delt materiale med en beregningsorientert samling å forutsi uttrykk i hele organer15. Mens hele-mount refererer vanligvis til hele organismer12, refererer her hele-mount til hele guts eller organer. Fordelene med å bruke hele-mount RNA i situ hybridisering tilnærmingen for å vurdere arkitektur tick tarmen bakterieflora er mangfoldige. Tick tarmen består av 7 diverticula, hvert par varierer i størrelse16. De funksjonelle forskjellene, sjekke hvis noen, blant disse diverticula, ikke er forstått i sammenheng med tick biologi, bakterieflora eller kryss-patogen interaksjoner. Manipulering av tarmen som ruptur gut diverticula vil fortrenge bakterieflora i tarmen lumen eller de løst med gut og resultatet i feiltolkning av den romlige lokaliseringen av bakterieflora. Fluorescens-merket RNA i situ hybridisering har vært benyttet tidligere for å undersøke tick gut transkripsjoner17 ved å feste og åpne personlige gut diverticula å sikre sonde hybridisering og lokalisere B. burgdorferi transkripsjoner av skjæring parafin-embedded hele flått18. Begge disse metodene krever manipulasjoner av tick vev før hybridisering som vil påvirke gut microbiota arkitektur.
I denne rapporten beskrive vi i detalj protokollen for å undersøke levedyktig tick tarmen bakterieflora bruker hele-mount i situ hybridisering (WMISH). Bruk av hele-mount RNA i situ hybridisering muliggjør en global forståelse av nærværet og overflod av bestemte gut bakterier i forskjellige regioner i tarmen og kan anspore ny innsikt i kryss gut biologi i sammenheng med patogen kolonisering og overføring. Videre oppdages bruk av RNA sonder rettet mot bestemte bakteriell RNA av levedyktig bakterier i tarmen tick.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette er den første bruken av en hel-mount i situ hybridisering (WMISH) teknikk å studere bakterieflora i en Leddyr vektoren patogener. Våre protokollen ble tilpasset fra som brukes til å studere utviklingen i Drosophila og frosk embryo25,26. Hele-mount RNA i situ hybridisering rutinemessig er brukt til å lokalisere genet transkripsjoner romlig og timelig27 og visualisering av utskrifter kan gjøres av lyse-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi Takk oppriktig Dr. Mustafa Khokha, Yale University, for å gi hans laboratorium ressursbruk. Vi er takknemlige for Mr. Ming-Jie Wu for utmerket kundestøtte. LoF er en HHMI etterforsker. Dette arbeidet ble støttet av en gave fra John Monsky og Jennifer Weis Monsky Lyme sykdom Research Fund.
Materials
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
Referências
- Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
- Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
- Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
- Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
- Grigor’eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
- Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
- Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
- Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
- Sonenshine, D. E. . Biology of ticks. , (1991).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
- Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase–an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
- Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
- Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
- Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
- Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
- Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).
