Visualisering av bakterieflora i Tick tarmar av hela-mount In Situ hybridisering
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att spatialt och temporalt bedöma förekomst av livskraftiga bakterieflora i tick tarmar med en modifierad hela-mount in situ hybridisering metod.
Abstract
Smittsamma sjukdomar som överförs av leddjur vektorer fortsätter att utgöra ett betydande hot mot människors hälsa i hela världen. De patogener som orsakar dessa sjukdomar, existerar inte isolerat när de kolonisera vektorn; de bedriver snarare sannolikt interaktioner med inhemska mikroorganismer i tarmen lumen. Den vektor bakterieflora har visat sig spela en viktig roll i patogener överföring för flera vektorburna sjukdomar. Om inhemska bakterier i tarmen av fästingen Ixodes scapularis , vektorn av flera mänskliga patogener inklusive Borrelia burgdorferi, påverka fästingen överföring av patogener bestäms inte. Vi kräver metoder för karaktärisering sammansättningen av de bakterier som är associerade med Markera tarmen att underlätta en bättre förståelse av potentiella mellan arterna interaktioner i tick tarmen. Med hela-fäste i situ möjliggör hybridisering att visualisera RNA avskrifter är associerad med viss bakterieart insamling av kvalitativa data om överflödet och distribution av bakterieflora i intakt vävnad. Denna teknik kan användas för att undersöka förändringar i tarmen bakterieflora miljö under loppet av tick utfodring och kan också användas för att analysera tick genuttryck. Färgning av hela fästing tarmar avkastning information om brutto rumslig distribution av målet RNA i vävnaden utan behov av tredimensionell rekonstruktion och påverkas mindre av miljöförorening, som ofta förvirrar den sekvensering-baserade metoder som ofta används för att studera komplexa mikrobiella samhällen. Sammantaget är denna teknik ett värdefullt verktyg som kan användas för att bättre förstå vektor-patogen-bakterieflora interaktioner och deras roll i sjukdomsspridning.
Introduction
Mänskliga och boskap patogener överförs av leddjur vektorer finns över hela världen och står för ca 20% av infektionssjukdomar globalt1, men effektivt och säkert vaccin mot de flesta av dessa patogener är inte tillgängliga. Vår förståelse av den viktiga rollen som kommensaler, symbiotiska och patogena mikroorganismer, gemensamt benämnda mikrobiomet2, modulerande och formar hälsan hos nästan alla metazoans3 växer. Nu är det uppenbart att leddjur vektorer av patogener även hysa tarmfloran och dessa vektor-associerade bakterieflora har visat sig påverka olika vektorburna patogener4,5. Den leddjur mikrobiomet består av eubacteria, arkéer, virus och eukaryota mikrober som protozoer, nematoder och svampar6. Dock har dominera forskningens fokus funnits på eubacteria vederbörlig, delvis, tillgängligheten av markörgener och referensdatabaser att identifiera specifika bakteriell medlemmar.
Med fokus på Ixodes scapularis, tick vektorn av flera mänskliga patogener inklusive Borrelia burgdorferi7, vilka smittämnen av borrelia, optimering av en mikrobiell visualisering teknik syftade att förbättra vår förståelse av tick tarmfloran i samband med vector-patogen interaktioner. Flera frågor återstår för att besvaras i fältet Markera mikrobiomet. Tarmen är platsen för det första utöka mötet mellan fästingen och inkommande patogenet i samband med horisontellt överförda patogener. Därför kommer att förstå rollen som vektor tarmfloran i modulerande vektor-patogen interaktioner avslöja meningsfulla insikter. Fästingar har ett unik läge av blodmjöl matsmältningen, där bearbetning av blodmjöl komponenter tar placera intracellulärt8. Gut lumen till synes fungerar som ett fartyg ska innehålla blodmjöl som tickande feeds, och näringsämnen matsmältning och assimilering uppstå under flera dagar av utfodring och fortsätta efter tillskott. De patogener som fästingen förvärvat under utfodring ange gut lumen tillsammans med blodmjöl och lumen blir således en primär plats av interaktioner bland tickande, patogen och bosatt bakterieflora. Som matsmältningen vinning genom tillskott och Ixodid tick ömsat, genomgår tarmen strukturella och funktionella förändringar9. Sammansättning och den rumsliga organisationen av tarmbakterier är också sannolikt att variera i samförstånd med den föränderliga gut-miljön. Det är därför viktigt att förstå arkitekturen av bosatta Vanliga magbakterier kryssa till fullo förstå samspelet mellan fästing, patogen och tarmfloran.
Molekylära metoder för att beskriva värd-associerade bakterieflora rutinmässigt använda hög genomströmning parallella sekvensering strategier10 för att förstärka och sekvens bakteriell 16S ribosomal DNA (rDNA). Dessa sekvensering strategier kringgå behovet av att få axenic kulturer av särskilda bakterier och ger en fördjupad Beskrivning av alla bakteriella medlemmar representerade i provet. Dock sådana strategier är tvetydiga på grund av oförmågan att skilja miljömässiga föroreningar från bona fide invånare. Ytterligare, när bedömningen av prover, såsom fästingar, som är liten i storlek och därmed innehåller låg bakterieflora-specifika DNA ger, sannolikheten för förstärkning av miljögifter är ökad11 och resulterar i en tvetydig tolkning av mikrobiomet sammansättning. Funktionell karakterisering tillsammans med visualisering av specifika livskraftiga bakterier blir därför avgörande för att definiera och urskilja mikrobiomet av fästingen temporally och rumsligt. Mot detta mål tog vi fördel av hela-mount RNA i situ hybridisering. Denna teknik används rutinmässigt bedöma gen uttrycksmönster i organ och embryon12,13,14 och möjliggör semikvantitativ analys av uttryck över hela provet av intresse. Detta skiljer sig från traditionella i situ hybridisering tekniker som utnyttjar vävnadssnitt och kräver ofta omfattande analys av sektionerad material med en computational församling att förutsäga uttryck i hela organ15. Medan hela-mount hänvisar generellt till hela organismer12, refererar här hela-mount till hela tarmar eller organ. Fördelarna med att använda den hela-mount RNA in situ hybridisering-metoden för att bedöma arkitekturen av tick tarmfloran är mångfacetterat. Markera tarmen består av 7 par av diverticula, varje par varierande i storlek16. Funktionella skillnader, kryssa om någon, bland dessa diverticula, inte förstås i samband med tick biologi, bakterieflora eller tick-patogen interaktioner. Manipulationer av tarmen som brista i tarmen diverticula skulle förskjuta bakterieflora i tarmen lumen eller de löst kopplade tarmen och resultera i felaktig tolkning av den rumsliga lokaliseringen av bakterieflora. Fluorescens-märkt RNA i situ hybridisering har använts tidigare för att undersöka tick gut avskrifter17 genom fastställande och öppna enskilda tarmen diverticula att säkerställa sonden hybridisering och lokalisera B. burgdorferi avskrifter av snittning paraffin-inbäddat hela fästingar18. Båda metoderna kräver manipulationer av tick vävnader före hybridisering som skulle påverka tarmen bakterieflora arkitekturen.
I den här rapporten beskriver vi i detalj i protokollet för att undersöka livskraftig tick tarmfloran med hela-fäste i situ hybridisering (WMISH). Användning av hela-mount RNA i situ hybridisering möjliggör en global förståelse av förekomsten och överflöd av specifika tarmbakterier i olika regioner i tarmen och kan sporra nya insikter i tick gut biologi i samband med patogener kolonisering och överföring. Användning av RNA sonder riktade mot specifika bakteriell RNA kan ytterligare, livskraftiga bakterier i tarmen fästing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta är den första användningen av en hela-fäste i situ hybridisering (WMISH) teknik för att studera bakterieflora av ett leddjur vektor av patogener. Våra protokoll anpassades från en används för att studera utvecklingen i Drosophila och grodan embryon25,26. Hela-mount RNA i situ hybridisering har rutinmässigt används för att lokalisera genen avskrifter rumsligt och tidsmässigt27 och visualisering …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Mustafa Khokha, Yale University, för att ge hans laboratorium resursanvändning. Vi är tacksamma att Mr Ming Jie Wu för utmärkt teknisk assistans. EF är en HHMI utredare. Detta arbete stöds av en gåva från John Monsky och Jennifer Weis Monsky Lyme Disease Research Fund.
Materials
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
Referências
- Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
- Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
- Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
- Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
- Grigor’eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
- Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
- Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
- Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
- Sonenshine, D. E. . Biology of ticks. , (1991).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
- Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase–an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
- Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
- Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
- Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
- Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
- Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).
