Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

Resumo

Descreveremos um protocolo para mapear a distribuição espacial da atividade enzimática por enzimas que geram nicotinatmide adenina dinucleótido fosfato (NAD(P)H) + H + diretamente em amostras de tecido.

Resumo

Mapeamento de atividade enzimática no espaço e no tempo é fundamental para o entendimento da base molecular do comportamento celular em tecido normal e doença. Ensaios de atividade metabólica in situ podem fornecer informações sobre a distribuição espacial da atividade metabólica dentro de um tecido. Nós fornecemos aqui um protocolo detalhado para monitorar a atividade da enzima lactato desidrogenase diretamente em amostras de tecido. Lactato desidrogenase é um determinante importante de se glicose consumida será convertido em energia via glicólise aeróbica ou anaeróbica. Uma solução contendo lactato e NAD é fornecida para uma secção de tecido congelado. Células com atividade alta lactato desidrogenase irão converter o fornecido lactato para piruvato, enquanto simultaneamente converter fornecido nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) para NADH e um próton, o que pode ser detectado com base na redução da nitrotetrazolium azul para formazan, que é visualizada como um precipitado azul. Descreveremos um protocolo detalhado para monitorar a atividade da lactato desidrogenase em pele de rato. Aplicação deste protocolo, encontramos que a atividade de lactato desidrogenase é alta em células-tronco a quiescente do folículo de cabelo dentro da pele. Aplicando o protocolo de células-tronco embrionárias cultivadas rato revelou maior coloração em células-tronco embrionárias cultivadas de fibroblastos embrionários de rato. Análise da aorta de rato recém isolado revelou coloração em células musculares lisas perpendicular à aorta. A metodologia fornecida pode ser usada para mapear espacialmente a atividade das enzimas que geram um próton em tecido congelado ou fresco.

Introdução

Compreender os locais dentro de tecidos em que as enzimas têm alta ou baixa atividade é essencial para a fisiologia e desenvolvimento da compreensão. Níveis de transcrição ou proteína são frequentemente utilizados como substitutos para a atividade enzimática. Embora tais estudos podem ser informativos, eles não fornecem informações que podem ser críticas para determinar a atividade de uma enzima, tais como modificações borne-translational, a presença de complexos de proteínas, ou Localização subcellular da enzima. Quando a atividade enzimática é medida diretamente, é frequentemente monitorado em proteína homogeneizada lysates que já não contêm informações sobre célula....

Protocolo

Todos os experimentos descritos foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal a Universidade da Califórnia, Los Angeles.

1. gerar Slides de pele de rato congelado

1. Eutanásia em ratos, em conformidade com a política da instituição.
   Nota: Siga a política institucional para vestuário de protecção. Todos os protocolos que envolvam animais devem ser aprovados pelo Comitê institucional Animal conta.
2. Remova o cabelo do rato com um aparador de pelos de animais.
3. Faça incisões na pele com uma tesoura. Usando fórceps, levante a pele longe do mouse. Usando a tesoura, corte a seção da pele.
4. Preencha o cryomold c....

Resultados

Nós já relatado resultados para ensaios em situ de atividade em pele de rato²⁰. Como mostrado na Figura 3, observou-se altos níveis de atividade da lactato desidrogenase em células-tronco no folículo piloso na base do folículo de cabelo quando os procedimentos descritos acima foram seguidos. Estas conclusões foram corroboradas pela célula de fluorescência ativada triagem de pele para pilhas de haste do folículo piloso e confir.......

Discussão

O método descrito aqui pode ser usado para monitorar a atividade da lactato desidrogenase ou outras enzimas metabólicas que geram NADH ou NADPH, em diferentes tipos de células em um tecido ou dentro de diferentes partes de um tecido ao longo do tempo. Lactato desidrogenase é uma enzima importante para a compreensão da biologia das células-tronco e tumores, e a capacidade de monitorar a atividade da lactato desidrogenase em células individuais é susceptível de fornecer importantes insights sobre a função desta enzima.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Instrumentos			Para coletar pele de camundongos eutanasiados
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm	Fisher Scientific	NC9511236	Para congelar pele
de camundongo Composto Tissue-Tek O.C.T. Fisher	Scientific	NC9638938	Para montagem de criomoldes
Balde de gelo	Fisher Scientific	07-210-106
Gelo seco
Corrediça de Adesão de Polisina	Fisher Scientific	12-545-78
4% formalina	Fisher Scientific	23-245-684	Diluído em água
solução salina tamponada com fosfato, pH 7.4
vórtice
Base Tris Fisher	Scientific	23-245-684
NAD	Sigma-Aldrich	N7004
Fenazina metossulfato	Sigma-Aldrich	P9625
Cloreto de azul de nitrotetrazólio	Sigma-Aldrich	N6876
L-lactato de lítio	Sigma-Aldrich	L2250	Substrato
37° C incubadora (ou incubadora de cultura de tecidos)
Braziliant! Contra-mancha	Anatech	861	Contra-mancha
Meio de montagem	Vector Laboratories	H-5000
Lamínulas para lâminas	Microscópio

cirúrgicos óptico Fisher Scientific 12-544D