इस अनुच्छेद में, हम एक प्राकृतिक क्षेत्र साइट से एकत्र कोशिकीय conjugating मनोरथ प्रजातियों के क्लोनिक संस्कृतियों की स्थापना का प्रदर्शन ।
यह शरीर विज्ञान, आनुवंशिकी, वर्गीकरण, और सूक्ष्म जीव विज्ञान के रूप में विभिंन विषयों, के अध्ययन में उपयोग के लिए सूक्ष्म शैवाल की क्लोनिंग संस्कृतियों की स्थापना के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, यह अत्यंत के लिए तकनीक विकसित करने के लिए क्लोनिंग संस्कृतियों की स्थापना महत्वपूर्ण है । इस अनुच्छेद में, हम एक conjugating alga की क्लोनिंग संस्कृतियों की स्थापना का प्रदर्शन । मैदान से पानी के नमूने एकत्र किए जाते हैं । बाद में, कोशिकाओं को एक गिलास केशिका पिपेट, मीडिया में रखा का उपयोग कर अलग कर रहे हैं, और एक क्लोनल संस्कृति पैदा करने के लिए उपयुक्त शर्तों के तहत हो ।
Conjugating शैवाल (आदेश Zygnematales के), भी conjugatophytes के रूप में जाना जाता है, भूमि1,2पौधों के तत्काल पूर्वजों के निकटतम रहने वाले रिश्तेदारों के रूप में एक महत्वपूर्ण वंशावली स्थिति पर कब्जा । शैवाल की स्थापना की क्लोनिक संस्कृतियों वर्गीकरण, शारीरिक, और आनुवंशिक अध्ययन की एक विस्तृत विविधता के लिए पिछले वर्षों में नेतृत्व किया है । एक प्राकृतिक क्षेत्र से सूक्ष्मजीवों के अलगाव की तकनीक एक लंबी परंपरा3,4है । हाल के वर्षों में, स्वचालित अलगाव प्रवाह cytometry का उपयोग कर तकनीक भी स्थापित किया गया है5। एक क्लोन संस्कृति की स्थापना के लिए एक एकल कोशिका प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल सबसे आम तरीका एकल सेल अलगाव एक ग्लास केशिका पिपेट6का उपयोग कर रहा है । इस पारंपरिक विधि कौशल और एक सटीक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की आवश्यकता है ।
इस अनुच्छेद में, हम क्षेत्र के नमूनों से शैवाल के नमूने और कोशिकीय conjugating शैवाल की क्लोनिंग संस्कृतियों की स्थापना का प्रदर्शन, जैसे Closterium प्रजातियों, एक ग्लास केशिका पिपेट का उपयोग कर । एक पानी वनस्पति कोशिकाओं से युक्त नमूना एक क्षेत्र साइट से एकत्र की है (जैसे, एक झील, तालाब, या धान क्षेत्र) । कोशिकाओं को एक ग्लास केशिका पिपेट का उपयोग करके पानी के नमूने से अलग कर रहे है और फिर धोया । कोशिकाओं एक परीक्षण ट्यूब में एक 16-एच प्रकाश के तहत 24 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन पूरक मध्यम (सीए माध्यम) से युक्त कर रहे हैं: 8-h अंधेरे शासन । इस विधि भी अंय सूक्ष्म शैवाल क्लोनिंग संस्कृतियों उत्पंन करने के लिए अलग करने के लिए उपयुक्त है ।
वर्तमान विधि का प्रयोग, Closterium सपा के 9 क्लोनिंग संस्कृति उपभेदों । 15 पानी के नमूने से पृथक कोशिकाओं से स्थापित किए गए (Inba1), एक ६०% सफलता दर का प्रतिनिधित्व । प्रजातियों की पहचान भविष्य में रूपात्मक अवलोकन के साथ-साथ, आणविक वंशावली विश्लेषण के रूप में डीएनए विश्लेषण के द्वारा किया जाएगा8.
वर्तमान विधि में पानी के नमूने की ताजगी सफलता दर के लिए महत्वपूर्ण है । क्षेत्र संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके पानी के नमूनों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए बेहतर है । हालांकि Closterium प्रजातियों की कोशिकाओं (जैसे, सी ehrenbergii, सी peracerosum-strigosum-littorale परिसर) के बारे में 7 डी के लिए पानी के नमूने में बनाए रखा जा सकता है यह 4-8 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से, कोशिकाओं के अलगाव वांछनीय है संग्रह के दिन या अगले दिन । यह भी लक्ष्य कोशिकाओं के अलावा अंय किसी भी दूषित पदार्थों को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है, तो धोने पुनरावृत्ति की संख्या में वृद्धि (यानी, > 3x) मिट्टी और कोशिकाओं में सूक्ष्मजीवों द्वारा संस्कृतियों के एक संदूषण को रोकने सकता है ।
इस तकनीक की एक सीमा है कि इस प्रोटोकॉल (ca या वातानुकूलित सीए माध्यम) में इस्तेमाल किया संस्कृति मीडिया हमेशा सभी conjugating शैवाल के लिए उपयुक्त नहीं हैं । कुछ मामलों में, यह एक और मध्यम, साथ ही विभिंन प्रकाश और तापमान की स्थिति का उपयोग करने पर विचार करने के लिए आवश्यक हो सकता है । इसके अलावा, के रूप में यह साबित करना है कि क्या एक संस्कृति एक एकल सेल से हो गया है मुश्किल है, यह सही केवल 1 सेल जब एक परीक्षण ट्यूब के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक है । इसलिए, स्थानांतरण एक नया ग्लास केशिका पिपेट हर बार के साथ किया जाना चाहिए ।
इस पिपेट धुलाई विधि के साथ एक क्लोनिंग संस्कृति की स्थापना एक शास्त्रीय/मानक विधि है और एक अध्ययन के लिए वांछित कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोग करने के लिए सबसे विश्वसनीय तरीका है । कई अध्ययनों में प्रयुक्त conjugating शैवाल की क्लोनिंग संस्कृतियों8,9,10,11 वर्तमान विधि का उपयोग कर स्थापित किया गया था । यह एक क्लोनिंग संस्कृति के बिना conjugating शैवाल का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल है । इसके अलावा, हाल के वर्षों में, डी नोवो पूरे जीनोम दृश्यों को प्राप्त करने के लिए आसान हो गया (उदाहरणके लिए, नोकर ट्विटर sequencer का उपयोग करके), और क्लोन संस्कृतियों की स्थापना आगे डी नोवो अनुक्रमण की सुविधा होगी । दूसरे शब्दों में, इस विधि से इन शैवालों के भविष्य के अध्ययन में पहला कदम उनकी जैव विविधता को बेहतर ढंग से समझना है.
आदेश में एक स्थिर संस्कृति तनाव स्थापित करने के लिए, यह सही प्रोटोकॉल के भीतर कुछ महत्वपूर्ण कदम प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है । सबसे महत्वपूर्ण कदम एक इष्टतम एपर्चर के साथ एक गिलास केशिका पिपेट की तैयारी केवल एक ही सेल के पारित होने की अनुमति है । कांच केशिका पिपेट के एपर्चर ब्याज की कोशिका के छोटे अक्ष लंबाई से थोड़ा अधिक होना चाहिए । इष्टतम कांच केशिका पिपेट केशिका क्रिया द्वारा एक एकल कोशिका महाप्राण कर सकते हैं । हालांकि, यदि एपर्चर का व्यास बहुत बड़ा है, केशिका भी contaminant सामग्री या यहां तक कि (एक) अंय जीव (ओं), लक्ष्य सेल के अलावा में आकर्षित करेगा ।
एक इष्टतम एपर्चर के साथ एक गिलास केशिका पिपेट प्राप्त करने के लिए, निम्न बिंदुओं पर ध्यान दें करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । कांच केशिका पिपेट ताप जब सबसे पहले, लौ के स्तंभ संकीर्ण होना चाहिए । अगला, जब पाश्चर पिपेट खींच, यह लौ से हटा दिया जाना है; अंयथा, पाश्चर पिपेट के एपर्चर गिर जाएगा ।
उपकरण और इस प्रोटोकॉल में दिखाया कंटेनरों बुनियादी रहे है और संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, बहु-अच्छी तरह से प्लेटें के बजाय एक अच्छी तरह से देखने के चश्मे का उपयोग करके, सेल धोने और अधिक कुशल बनाया जा सकता है । इसके अलावा, कंटेनरों अंय समान लोगों के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है । अंतिम चरण में संस्कृति माध्यम के लिए एक एकल कोशिका स्थानांतरित करके, एक क्लोनल संस्कृति स्थापित किया जा सकता है ।
एक निष्फल कंटेनर की तैयारी और एक डाकू में काम कर axenic (दूषित) उपभेदों स्थापित करेगा । संक्रमण को रोकने के लिए, यह ताजा aliquots 3x से अधिक के साथ धुलाई कदम दोहराने के लिए आवश्यक है । कई बार, जीवाणु15एंटीबायोटिक्स जोड़कर भी निष्फल हो जाते हैं ।
इस विधि desmid (Zygnematales) अलगाव पर ध्यान केंद्रित है, लेकिन कांच केशिका पिपेट एपर्चर के आकार को बदलकर, यह अलग आकार प्लवक के अलगाव के लिए लागू किया जा सकता है ।
हम Hisayoshi Nozaki (टोक्यो विश्वविद्यालय), Takashi Nakada (कईयो विश्वविद्यालय), युका Marukawa Hashimoto (जापान महिला विश्वविद्यालय), और हिरोयुकी Sekimoto (जापान महिला विश्वविद्यालय) का धन्यवाद करते हैं । हम उनकी टिप्पणियों के लिए समीक्षकों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । यह अध्ययन विज्ञान, जापान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी से वैज्ञानिक अनुसंधान (No. २६४४०२२३ और 15H04413) के लिए एक अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था, और युकी Tsuchikane के लिए नई प्रौद्योगिकी विकास फाउंडेशन से अनुदान द्वारा ।
Sampling | |||
Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
Preparation of a micropipette | |||
Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
Single-cell isolation | |||
Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |