I denne artikkelen viser vi etableringen av klonal kulturer encellede bøye alger arter fra et naturlig feltet område.
Det er viktig å etablere klonal kulturer av mikroalger for bruk i studier av forskjellige emner, som fysiologi, genetikk, taksonomi og mikrobiologi. Dermed er det svært viktig å utvikle teknikker for å etablere klonal kulturer. I denne artikkelen viser vi etableringen av klonal kulturer av en conjugating alga. Vannprøver fra feltet. Deretter er celler isolert ved hjelp av en glass kapillær pipette, plassert i media, og dyrket under betingelser egnet for å generere en klonal kultur.
Bøye alger (i orden Zygnematales), oppta også kjent som conjugatophytes, en nøkkel Fylogenetiske plasseringen som den nærmeste nålevende slektninger av Familiebakgrunn land planter1,2. Etablerte klonal kulturer av alger har ført til en rekke ulike taksonomiske, fysiologiske og genetiske studier de siste årene. Isolasjon teknikker av mikroorganismer fra et naturlig har en lang tradisjon3,4. De siste årene etablert automatisert isolering teknikker bruker flowcytometri har også vært5. Den vanligste metoden brukes til å innhente en enkeltcelle for etablering av en klonal kultur er encellede isolasjon bruker et glass kapillær pipette6. Denne tradisjonelle metoden krever dyktighet og en presis eksperimentelle protokoll.
I denne artikkelen viser vi prøvetaking av alger fra feltet prøver og etablering av klonal kulturer av encellede bøye alger, som Closterium arter, ved hjelp av en glass kapillær pipette. En vann utvalget inneholder vegetative celler samles fra et felt nettsted (f.eks, en innsjø, tjern eller paddy feltet). Cellene er isolert fra vann prøven ved hjelp av en glass kapillær pipette og deretter vasket. Cellene er kultivert i et reagensrør inneholder nitrogen-supplert medium (CA medium) på 24 ° C 16-h lys: 8-h mørke regimet. Denne metoden er også egnet for å isolere andre mikroalger å generere klonal kulturer.
Med metoden finnes ble 9 klonal kultur stammer Closterium SP etablert fra 15 celler isolert fra vann utvalget (Inba1), som representerer en 60% suksessrate. Identifisering av arter vil bli utført i fremtiden morfologiske observasjon samt DNA analyser, som molecular Fylogenetiske analyser8.
Metoden finnes er friskhet av det viktig å suksessraten. Det er bedre å isolere cellene fra vannprøver så snart som mulig etter feltet samlingen. Selv om celler av Closterium arter (f.eks C. ehrenbergii, C. peracerosum-lever-littorale komplekse) kan opprettholdes i vann utvalget for ca 7 d ved å lagre den på 4-8 ° C, er isolasjon cellene ønskelig på dagen for samlingen eller neste dag. Det er også viktig å fjerne eventuelle forurensninger enn målcellene, så øker antallet vask repetisjoner (dvs., > 3 x) kan hindre en forurensning av kulturer av mikroorganismer i jord og celler.
En begrensning av denne teknikken er at kultur mediene som brukes i denne protokollen (CA eller betinget CA medium) ikke er alltid passer for alle conjugating alger. I noen tilfeller kan det være nødvendig å vurdere å bruke et annet medium, samt annet lys og temperaturer. Også, som det er vanskelig å bevise om en kultur har vokst fra en enkelt celle, er det nødvendig å plukke bare 1 celle når du overfører celler til et reagensrør. Derfor skal overføring gjøres med en ny glass kapillær pipette hver gang.
Å etablere en klonal kultur med denne pipette vaske metoden er en klassisk/standard metode og er den mest pålitelige metoden for å isolere ønsket celler for en studie. Klonal kulturer å bøye alger brukes i mange studier8,9,10,11 ble etablert med metoden finnes. Det er vanskelig å analysere bøye alger uten en klonal kultur. Videre de siste årene, de novo hele genomet sekvenser ble lett å få (f.eksved hjelp av MinION nanopore sequenceren), og å etablere klonal kulturer vil ytterligere forenkle de novo sekvensering. Med andre ord, er denne metoden det første trinnet i fremtiden studie av disse alger til å forstå deres biologisk mangfold.
For å etablere et stabilt belastning, er det nødvendig å utføre visse kritiske trinn nøyaktig i protokollen. Viktigste er utarbeidelsen av en glass kapillær pipette med en optimal aperture å tillate passasje av bare enkeltceller. Åpningen av glasset kapillær pipette må være litt mer enn mindre aksen cellen rundt. Optimal glass kapillær pipette kan Sug opp en enkeltcelle kapillær handling. Men hvis diameteren på blenderåpningen er for stor, vil av kapillær også trekke i ikke-levende miljøgifter eller selv (en) andre organism(s), i tillegg til målcellen.
For å få en glass kapillær pipette med en optimal blenderåpning, er følgende punkter viktige å merke. Først må søyle av flammen være smal når oppvarming glass kapillær pipette. Deretter når Pasteur pipette, har den å bli fjernet fra flammen; ellers vil blenderåpning av Pasteur pipette kollapse.
Utstyr og beholdere i denne protokollen er grunnleggende og kan bli endret. For eksempel ved å bruke flere bra plater i stedet for å se glass med en brønn, kan celle vask gjøres mer effektiv. I tillegg kan beholdere erstattes for andre. Ved å overføre en enkeltcelle til kultur medium på siste trinn, kan en klonal kultur etableres.
Forberede en sterilisert beholder og arbeider i hette vil etablere axenic (forurenset) stammer. For å hindre forurensning, er det nødvendig å gjenta vask trinnet med fersk dele mer enn 3 x. Noen ganger er bakterier også steriliseres ved å legge til antibiotika15.
Denne metoden fokusert på desmid (Zygnematales) isolasjon, men ved å endre størrelsen på glass kapillær pipette blenderåpning, kan den brukes på isolasjon av forskjellig størrelse plankton.
Vi takker Hisayoshi Nozaki (Universitetet i Tokyo), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Japan kvinner University) og Hiroyuki Sekimoto (Japan kvinner University). Vi ønsker å takke korrekturleserne for deres kommentarer. Denne studien ble støttet av en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (nr 26440223 og 15H 04413) fra Japan Society for fremme av vitenskap, Japan, og av et stipend fra den nye teknologien Development Foundation til Yuki Tsuchikane.
Sampling | |||
Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
Preparation of a micropipette | |||
Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
Single-cell isolation | |||
Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |