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Bioengenharia

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

Published: August 10, 2018
doi:
10.3791/57763
, , , , , , , ,
1Department of Bioengineering,The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering,UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering,Shenzhen Technology University

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare lo sviluppo di cuori in zebrafish in 4 dimensioni (4D). Imaging 4D, tramite microscopia di fluorescenza di luce-foglio (LSFM), prende 3-dimensionale (3D) immagini nel corso del tempo, di ricostruire i cuori in via di sviluppo. Indichiamo qualitativamente e quantitativamente che lo shear stress attiva endocardial tacca di segnalazione durante lo sviluppo di camera, che promuove trabeculation cardiaco.

Abstract

Le forze emodinamiche sperimentato dagli sviluppo cardiaco di influenza cuore, soprattutto trabeculation, che forma una rete di ramificazione escrescenze dal miocardio. Programma genetico difetti nella tacca di segnalazione cascata sono coinvolti nei difetti ventricolari come cardiomiopatia Non-consolidamento ventricolare sinistra o sindrome del cuore sinistro ipoplasico. Usando questo protocollo, è possibile determinare che la sollecitazione di taglio guidato trabeculation e tacca di segnalazione siano legati uno a altro. Utilizzando la microscopia a fluorescenza luce-foglio, visualizzazione del cuore zebrafish sviluppo era possibile. In questo manoscritto, si è valutato se forze emodinamiche modulano l’iniziazione del trabeculation via tacca di segnalazione e così, influenzano la funzione contrattile si verifica. Per qualitativa e quantitativa shear stress analysis, 4-D (3-D + tempo) immagini sono state acquisite durante la morfogenesi cardiaca zebrafish e microscopia di fluorescenza di luce-foglio integrato con sincronizzazione 4D catturato il movimento ventricolare. Viscosità del sangue è stata ridotta tramite gata1a– morpholino oligonucleotidi (MO) micro-iniezione per diminuire la sollecitazione di taglio, quindi, giù-regolando la tacca di segnalazione e attenuando trabeculation. Co-iniezione di Nrg1 mRNA con gata1a MO salvato geni correlati alla tacca per ripristinare trabeculation. Per confermare la sollecitazione di taglio guidato tacca di segnalazione influenze trabeculation, contrazione dei cardiomiociti più ulteriormente è stato arrestato tramite tnnt2a-MO per ridurre le forze emodinamiche, quindi, down-regolazione di geni bersaglio tacca per sviluppare un non-trabecolazioni miocardio. Infine, conferma dei pattern di espressione dei geni Notch sollecitazione di taglio è stata condotta sottoponendo le cellule endoteliali a flusso pulsatile. Così, la microscopia di luce-foglio 4-D scoperto forze emodinamiche sottostante tacca di segnalazione e trabeculation con rilevanza clinica di cardiomiopatia non-consolidamento.

Introduction

Le forze biomeccaniche, quali emodinamico shear stress, sono intimamente coinvolti nella morfogenesi cardiaca. In risposta a forze di taglio emodinamico, scanalature e creste del miocardio si sviluppano in una rete trabecolare ondulatorio in allineamento con la regia della sollecitazione di taglio attraverso la valvola di atrioventricolare (AV)1. Trabeculation cardiaca è necessario aumentare la funzione contrattile e la massa del miocardio2. Le mutazioni in vie di segnalazione Notch provocano difetti cardiaci congeniti in esseri umani ed altri vertebrati3. Ad esempio, gata1a4 e tnnt2a5 morpholino oligonucleotidi (MO) sono stati indicati per ridurre la eritropoiesi, mentre l’eritropoietina (EPO) mRNA6 e isoproterenolo (ISO)7 aumentare rosso sangue cellule e frequenza cardiaca rispettivamente e di conseguenza parete shear stress (WSS). Inoltre, segnalazione di ErbB2, a valle della tacca, promuove la proliferazione dei cardiomiociti e differenziazione per generare forza contrattile, che a sua volta attiva Notch segnalazione8,9. È suggerito che lo shear stress governa Notch segnalazione trabeculation guidato per sviluppo ventricolare. Attualmente, ci sono molti studi che tentano di capire meglio gli eventi programmazione genetici che portano al cuore congenito difetti (CHD)10,11,12, ma molto poco stanno studiando come forze meccaniche influenzano che formano il cuore.

Al fine di indagare le forze meccaniche che agisce sull’endocardio, stretta osservazione durante il periodo dello sviluppo deve essere attuata. Tuttavia, è difficile da ottenere immagini di buona qualità di in vivo battendo campioni dovuto l’inerenza della microscopia tradizionale13. Al fine di osservare l’evoluzione nel tempo all’interno di un campione, fisico di sezionamento e di colorazione, pertanto, necessario verificarsi13,14,15. Sebbene la microscopia confocale è ampiamente usata per l’immagine della struttura 3-d di campioni14,16, acquisizione di questi sistemi di imaging ancora è limitata dalla velocità di scansione lenta.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio (LSFM) è una tecnica di imaging unica che permette la visualizzazione in vivo di eventi dinamici con lungo lavoro distanza13. Questa tecnica usa un microscopio fluorescente a luce-foglio per sezione otticamente un esempio17. A causa di illuminazione di solo un foglio sottile di luce sul campione, c’è una riduzione in foto-candeggio e foto tossicità13,18. Il grande campo di vista e lunga distanza di lavoro consente per grandi campioni a rimanere intatto come sono imaged13,14,17. Il basso ingrandimento permette un’area più grande essere imaged, mentre la lunga distanza di lavoro consente per i campioni più spessi essere imaged senza compromettere il rapporto segnale-rumore. Molti gruppi hanno utilizzato LSFM a immagine intera embrioni17, cervelli14,18, muscoli e cuori19 fra altri tessuti, che mostra i diversi tipi di campioni che possono essere imaged.

Anche se la ricerca precedente ha dimostrato ridotto sforzo emodinamico occludendo le tracce afflusso o deflusso del cuore zebrafish, le informazioni sono esclusivamente qualitative. Provoca un’anormale terza sezione, ciclo cardiaco diminuito e valvola alterata formazione20. Le immagini LSFM 4D dare una nuova prospettiva nel senso che la cesoia emodinamica forze influenzano lo sviluppo del tessuto cardiaco. Queste forze meccaniche possono attivare le molecole di segnalazione sensibili alla forza e indurre la formazione delle creste trabecular. Dato l’aspetto di tempo aggiunto dell’imaging 4D, uno è in grado di tenere traccia delle modifiche in fase di sviluppo in tempo reale, che potrebbe portare a nuove rivelazioni che erano passata inosservate in precedenza. Zebrafish è un modello ideale per l’imaging perché gli scienziati possono osservare un intero animale vertebrato contro solo interazioni cellula-cellula. Ossigeno può diffondersi anche attraverso l’intero embrione, che permette lo sviluppo avvengono senza a seconda del sistema vascolare, a differenza nello sviluppo dei mammiferi. Anche se il cuore di zebrafish manca gli organi polmonari, che richiedono un cuore quattro-a temperatura ambiente, c’è un gran numero di geni cardiaci che sono conservate tra zebrafish e gli esseri umani21.

In questo manoscritto, descriviamo come utilizzare microscopia di fluorescenza di luce-foglio all’immagine le trabecole in via di sviluppo nei cuori di zebrafish in varie circostanze. In primo luogo, l’iniezione di gata1a4 o tnnt2a5 MOs sono stati utilizzati a bassa viscosità del sangue e di conseguenza WSS. La morfologia del cuore è stato poi registrata. In un gruppo separato di pesce, abbiamo aumentato il WSS con la somministrazione di EPO mRNA6 o isoproterenolo7 e osservate i risultati. Inoltre abbiamo condotto uno studio di cellulare con diverse portate pulsatile o oscillatorio. Dopo ogni gruppo di imaging, abbiamo trovato che WSS percepita da endocardio via Notch segnalazione iniziati trabeculation.

Protocol

I metodi seguenti sono stati eseguiti in conformità a protocolli UTA e UCLA IACUC. Questi gruppi sperimentali sono stati usati con transgenici Tg(cmlc2:gfp), i mutanti wea (debole atrium) o clo (cloche) : controllo (a) wild-type (WT), (b) gata1a MO e iniezioni (c) tnnt2a MO (tabella 1). Modello Nome …

Representative Results

LSFM è stato usato in questo manoscritto al fine di acquisire immagini 2D e 3D ad alta risoluzione. Come visto in Figura 1A e 1B, la lente di illuminazione dirige il foglio leggero al campione. A causa della magrezza del foglio luce, solo un unico piano è illuminato. La lente di rilevamento viene posizionata perpendicolarmente alla lente illuminazione e si concentra sul piano illuminato (Figura 1B). Il foglio l…

Discussion

In questo protocollo, abbiamo dimostrato che imaging 4D può essere utilizzato per monitorare lo sviluppo di una rete trabecolare in risposta ai cambiamenti nelle forze biomeccaniche. In particolare, la sollecitazione di taglio con esperienza dalle cellule endoteliali avvia la tacca di segnalazione cascade, che a sua volta promuove trabeculation. In questo manoscritto, abbiamo indicato che (1) gata1a MO iniezione ha ridotto l’ematopoiesi e pertanto ridotta sollecitazione di taglio della parete, (2) tnnt2a</e…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero esprimere gratitudine a William Talbot presso la Stanford University per fornire l’essere umano Nrg1 cDNA e di Deborah Yelon da UCSD per fornire la WEA mutanti. Gli autori piacerebbe anche ringraziare Cynthia Chen per aiutare con l’acquisizione di immagini. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH HL118650 (a T.K. Hsiai), HL083015 (a T.K. Hsiai), HD069305 (per Chi N.C. e T.K. Hsiai.), HL111437 (per T.K. Hsiai e Chi N.C.), HL129727 (a T.K. Hsiai), T32HL007895 (a R.R. Sevag Packard), HL 134613 (da V. Messerschmidt) e Università del Texas sistema stelle fondi (di J. Lee).

Materials

Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis
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Referências

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Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).
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