צבען FM רכיבה על הסינפסה: השוואה בין דפולריזציה אשלגן גבוהה, חשמל וגירוי Channelrhodopsin
Summary
שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו – ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .
Abstract
FM צבעים משמשים כדי ללמוד את מחזור שלפוחית סינפטית (SV). הגששים amphipathic אלה יש הידרופילית בראש וזנב הידרופובי, הפיכתם מסיסים במים עם היכולת להיכנס ולצאת ממברנה השומנים bilayers הפיכה. צבעי styryl אלה הם יחסית ללא-פלורסנט במדיום מימית, אבל הכניסה לתוך העלעל החיצוני של קרום פלזמה גורם > 40 X לודיג זריחה. ב הסינפסות עצביים, צבעי FM הם הפנימו במהלך SV אנדוציטוזה, אקסוציטוזה SV הנסחרות הן בתוך והן בין בריכות SV, ואשר פורסמו עם, מתן כלי רב עוצמה כדי להמחיש presynaptic שלבי עצבית. מודל גנטי העיקרי של glutamatergic סינפסה התפתחות ותפקוד היא דרוזופילה צומת עצב-שריר (NMJ), איפה FM לצבוע הדמיה שימש בהרחבה לכמת SV dynamics במגוון רחב של תנאים מוטציה. הטרמינל סינפטית NMJ הינו נגיש בקלות, עם מגוון יפה של גדול סינפטית עם העיתון ons אידיאלי עבור הדמיה יישומים. כאן, אנו משווים חדות משלוש דרכים לעורר את דרוזופילה NMJ לנהוג תלויי-פעילות FM1-43 צבע ספיגת/שחרור…: אמבט 1) יישום של גבוהה [K+] depolarize רקמות עצב-שריר, 2) יניקה עצבים מוטוריים אלקטרודה גירוי depolarize העצב presynaptic מסוף, ו 3) לפלח הטרנסגניים ביטוי של משתנים channelrhodopsin עבור שליטה גירוי האור, המרחבי של דפולריזציה. כל השיטות האלה יש יתרונות וחסרונות לחקר השפעות מוטציה גנטית על מחזור SV- דרוזופילה NMJ. נדון אלה יתרונות וחסרונות לסייע הבחירה של הגישה גירוי, יחד עם מתודולוגיות ספציפיות לכל אסטרטגיה. בנוסף הדמיה פלורסנט, FM צבע יכול להיות photoconverted לאותות צפיפות אלקטרונים visualized באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הילוכים (TEM) ללמוד SV מנגנונים מחזור ברמה ultrastructural. אנו מספקים את ההשוואות של קונאפוקלית ואלקטרון הדמיה של השיטות השונות של גירוי דרוזופילה NMJ, כמדריך הבחירה של פרדיגמות ניסיוני בעתיד.
Introduction
מאופיין להפליא דרוזופילה צומת עצב-שריר זחל (NMJ) glutamatergic סינפסה הדגם שימש ללמוד סינפסה היווצרות ותפקוד עם מגוון עצום של לפליטת גנטי1. הטרמינל מוטור נוירון מורכב רב ענפים האקסון, כל אחד עם העיתון ons מוגדלת סינפטיים רבים. אלה varicosities מרווח (עד 5 מיקרומטר בקוטר) לכלול את כל המנגנון עצבית, כולל הסינפטיות glutamatergic אחיד (SVs; ~ 40 ננומטר בקוטר) שמורת cytosolic ובריכות בקלות releasable2. שלפוחית אלה עוגנות קרום פלזמה presynaptic פיוז’ן אתר פעיל אזורי (AZs), שבו אקסוציטוזה שמתווכת שחרור נוירוטרנסמיטר גלוטמט עבור טרנס-סינפטית תקשורת. לאחר מכן, SVs מאוחזרות של קרום פלזמה דרך נשיקה-וברח מיחזור או בתיווך clathrin אנדוציטוזה (CME) מחזורים חוזרים ונשנים exo/אנדוציטוזה. דרוזופילה NMJ ונגיש בקלות מתאים היטב הן בידוד ואפיון מוטנטים מחזור SV. באמצעות מסכי גנטי קדימה, מוטציות הרומן הובילו זיהוי גנים חדשים קריטיים עבור מחזור SV3. יתר על כן, הפוך גישות גנטיות מתחיל עם הגנים ידוע כבר הובילו הבהרה של מנגנוני מחזור SV חדשים דרך התיאור זהיר של מוטציה רכיבה על אופניים פנוטיפים4. דרוזופילה NMJ אידיאלי כמעט כהכנה סינפטית ניסיוני ניקוד אנדוציטוזה SV מנגנונים אקסוציטוזה באמצעות שיטות שטיחות שלפוחית מסלול רכיבה על אופניים במהלך עצבית.
מגוון של סמנים פלורסנט לאפשר מעקב ויזואלי של שלפוחית במהלך רכיבה על אופניים dynamics, אבל הרב-גוניים ביותר הם תחליפי לצבוע FM אשר הוא קודם מסונתז על ידי מאו,. פ, ואח. 5. מבחינה מבנית, FM צבעים מכילים הידרופילית ראש וזנב lipophilic מחובר באמצעות טבעת ארומטית, עם אזור מרכזי היוועצות ספקטראליות. אלה styryl צבעי למחיצות הפיכה של ממברנות, לא ‘משתנים’ בין קרום פליירים, וכך גם אף פעם לא להכניס ציטוזול, ויש הרבה יותר פלורסנט בתוך ממברנות יותר מים5. הכניסה הפיך לתוך ליפידית גורמת עלייה 40-fold קרינה פלואורסצנטית6. ב הסינפסות עצביים, ניסויים תיוג לצבוע FM קלאסי מורכב רחצה ההכנה סינפטית עם לצבוע במהלך depolarizing גירוי לטעון לצבוע באמצעות SV אנדוציטוזה. צבע חיצוני ואז נשטף הרחק, מחזור SV נעצר בפתרון צלצול נטולת סידן לשיקוף הסינפסות טעון7. סיבוב שני של גירוי באמבט ללא צבע מעורר שחרור FM דרך אקסוציטוזה, תהליך זה יכול להיות מלווה מדידה הירידה עוצמת קרינה פלואורסצנטית. אוכלוסיות SV מן שלפוחית יחיד אל בריכות המכיל מאות שלפוחית יכול להיות מנוטרים באופן כמותי6,7. צבעי FM שימשו לנתח תלויי-פעילות גיוס של בריכות SV נפרדים פונקציונלית, והשווה נשיקה-וברח לעומת CME רכיבה8,9. השיטה שונתה כדי בנפרד assay עורר, ספונטנית, זעיר סינפטית מחזור פעילות (עם ציוד רגישה מאוד לזהות שינויים קטנים מאוד פלורסצנטיות ולהפחית את photobleaching)10. מבחני ניתן להרחיב את רמת ultrastructural על ידי photoconverting האות FM פלורסנט לתוך תווית צפיפות אלקטרונים עבור שידור מיקרוסקופ אלקטרונים11,12,13,14 .
מבחינה היסטורית, רחצה ההכנות סינפטית בריכוז גבוה של אשלגן (ןלהל “גבוהה [K+]”) הייתה השיטה של בחירה עבור depolarizing גירוי לזירוז SV רכיבה על אופניים; החל הצפרדע שימוש NMJ5, מחונן המוח מכרסמים נוירונים בהיפוקמפוס15, דרוזופילה glutamatergic NMJ דגם16,17 הגישה [K+] גבוהה זו היא פשוטה, דורש אין ציוד מיוחד, ולא נגיש ולכן רוב מעבדות, אבל יש מגבלות עבור היישום והן פרשנות הנתונים. שיטה המתאימה יותר מבחינה פיזיולוגית היא להשתמש אלקטרודה היניקה גירוי חשמלי של עצב4,5,12. גישה זו נוהג פוטנציאל הפעולה הפצת לגירוי ישיר של העצב presynaptic מסוף, ואת התוצאות ניתן להשוות ישירות אל מבחני אלקטרופיזיולוגיות עצבית פונקציה13,14, 15, אבל דורש ציוד מיוחד, היא טכנית הרבה יותר מאתגר. עם כניסתו של optogenetics, השימוש של גירויים עצביים channelrhodopsin יש יתרונות נוספים, כולל שליטה הדוקה ייתכן ערוץ ביטוי באמצעות מערכת Gal4/UAS בינארי20. גישה זו טכנית הרבה יותר קל מאשר שאיבה אלקטרודה לגירוי ואינו דורש לא יותר מאשר מקור אור LED זול מאוד. כאן, אנו מעסיקים הדמיה של FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) לעשות הן השוואות אלה שלוש שיטות שונות גירוי- דרוזופילה NMJ: high פשוטים [K+ ], מאתגר גישות channelrhodopsin חשמל וחדשים.
Protocol
Representative Results
Discussion
גירוי גבוה [K+] מלוחים depolarizing הוא והכי מתוך שלושת האפשרויות עבור צבע FM תלויי-פעילות רכיבה על אופניים, אבל סביר להניח פיזיולוגיים לפחות29. שיטה פשוטה זו depolarizes כל תא נגיש החיה כולו, אז אינו מאפשר לימודים מכוונת. ייתכן ניתן להחיל באופן מקומי גבוה תמיסת מלח [K+] עם micropipette, א…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Broadie מעבדה חברים לתרומות למאמר זה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01s MH096832 ו- MH084989 כדי. תן לי לראות, ואחווה NIH predoctoral F31 MH111144 כדי D.L.K.
Materials
| SylGard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | To put on cover glass for dissections |
| Microscope Cover Glass 22×22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | To put SylGard on for dissections |
| Aluminum Top Hot Plate Type 2200 | Thermolyne | HPA2235M | To cure the SylGard |
| Plexi glass dissection chamber | N/A | N/A | Handmade |
| Borosilicate Glass Capillaries | WPI | 1B100F-4 | To make suction and glue micropipettes |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-2000 | To make suction and glue micropipettes |
| Tygon E-3603 Laboratory Tubing | Component Supply Co. | TET-031A | For mouth and suction pipette |
| P2 pipette tip | USA Scientific | 1111-3700 | For mouth pipette |
| 0.6-mL Eppendorf tube cap | Fisher Scientific | 05-408-120 | Used to put glue in for dissection |
| Vetbond 3M | WPI | vetbond | Glue used for dissections |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P-217 | Forsaline |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S5886 | For saline |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M35-500 | For saline |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | For saline |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | For saline |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | For saline |
| HRP:Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | To label neuronal membranes |
| Paintbrush | Winsor & Newton | 94376864793 | To manipulate the larvae |
| Dumont Dumostar Tweezers #5 | WPI | 500233 | Used during dissection |
| 7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) | WPI | 14177 | Used during dissection |
| FM1-43 | Fisher Scientific | T35356 | Fluorescent styryl dye |
| Digital Timer | VWR | 62344-641 | For timing FM dye load/unload |
| LSM 510 META laser-scanning confocal microscope | Zeiss | For imaging the fluorescent markers | |
| Zen 2009 SP2 version 6.0 | Zeiss | Software for imaging on confocal | |
| HeNe 633nm laser | Lasos | To excite HRP:647 during imaging | |
| Argon 488nm laser | Lasos | To excite the FM dye during imaging | |
| Micro-Forge | WPI | MF200 | To fire polish glass micropipettes |
| 20mL Syringe Slip Tip | BD | 301625 | To suck up the axon for electrical stimulation. |
| Micro Manipulator (magnetic base) | Narishige | MMN-9 | To control the suction electrode for electrical stimulation |
| Stimulator | Grass | S48 | To control the LED and electrical stimulation |
| Zeiss Axioskop Microscope | Zeiss | Used during electrical stimulation. | |
| 40X Achroplan Water Immersion Objective | Zeiss | Used during electrical stimulation and confocal imaging | |
| All-trans Retinal | Millipore Sigma | R2500 | Essential co-factor for ChR2 |
| Zeiss Stemi Microscope with camera port | Zeiss | 2000-C | Used during channelrhodopsin stimulation |
| LED 470nm | ThorLabs | M470L2 | Used for ChR activation |
| T-Cube LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | To control the LED |
| LED Power Supply | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | To power the LED |
| Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | To measure LED intensity |
Referências
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
- Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
- Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
- Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
- Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
- Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
- Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
- Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
- Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
- Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
- Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
- Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
- Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
- Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
- Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. . Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
- Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
- Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
- Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , (2012).
- Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
- Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
- Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
- Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
- Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
- Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
- Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
- Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
- Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
- Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
- Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
- Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).
