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Neurociência

FM-Farbstoff Radfahren an der Synapse: Vergleich hohen Kalium Depolarisation, elektrische und Channelrhodopsin Stimulation

Published: May 24, 2018
doi:
10.3791/57765
,
1Department of Biological Sciences,Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development,Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Synaptischen Vesikel (SV) Radfahren ist der Kern-Mechanismus der interzellulären Kommunikation bei neuronalen Synapsen. FM-Farbstoff-Aufnahme und Veröffentlichung sind die Primärmittel des quantitativ prüfen SV Endo- und Exozytose. Hier vergleichen wir alle stimulationsmethoden FM1-43 Radfahren an der Drosophila neuromuskulären (NMJ) Modell Synapse zu fahren.

Abstract

FM-Farbstoffe werden verwendet, um die synaptischen Vesikel (SV)-Zyklus zu studieren. Diese amphipathische Sonden haben einen hydrophilen Kopf und hydrophoben Schweif, so dass sie mit der Fähigkeit, reversibel betreten und verlassen der Membran Lipid Bilayer wasserlöslich. Diese Styryl-Farbstoffe sind relativ nicht fluoreszierenden in wässrigen Medium, aber Einfügung in die äußeren Broschüre der Plasmamembran verursacht einen > 40 X Anstieg der Fluoreszenz. In neuronalen Synapsen sind FM Farbstoffe beim SV Endozytose, verschleppte sowohl innerhalb als auch zwischen SV Pools, und veröffentlichte mit SV Exozytose, bietet ein leistungsstarkes Tool zur Visualisierung der präsynaptischen Stadien der Neurotransmission verinnerlicht. Einen primären genetischen Modell von glutamatergen Synapsen Entwicklung und Funktion ist der Drosophila neuromuskulären Synapse (NMJ), wo FM färben Bildgebung weitgehend verwendet worden ist, SV Dynamik in einer Vielzahl von mutierten Bedingungen zu quantifizieren. NMJ synaptischen Terminals ist leicht zugänglich, mit einer schönen Auswahl an großen synaptischen Boutons ideal für imaging-Anwendungen. Hier, wir vergleichen und kontrastieren die drei Möglichkeiten zur Förderung der Drosophila NMJ aktivitätsabhängige FM1-43 Farbstoff Aufnahme/Entlassung zu fahren: (1) Bad Anwendung hoher [K+] zu depolarisieren neuromuskuläre Gewebe, 2) Saug-Elektrode motorischen Nerven Anregung zu depolarisieren den präsynaptischen Nerv Klemme, und 3) gezielte transgene Ausdruck Channelrhodopsin Varianten für Licht angeregt, räumliche Kontrolle der Depolarisation. Jede dieser Methoden hat vor- und Nachteile für die Untersuchung der genetischen Mutation Auswirkungen auf die SV-Zyklus bei Drosophila NMJ. Wir besprechen diese vor- und Nachteile, die Auswahl der Stimulation Ansatz, zusammen mit den Methoden, die spezifisch für jede Strategie zu unterstützen. Neben fluoreszierende Bildgebung können FM Farbstoffe Photoconverted Elektron-Dichte Signale mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM), um SV Zyklus Mechanismen Ultrastrukturforschung Ebene zu studieren visualisiert werden. Wir bieten die Vergleiche der konfokalen und Elektronenmikroskopie imaging aus den verschiedenen Methoden der Drosophila NMJ Stimulation zu helfen die Auswahl der zukünftigen experimentelle Paradigmen.

Introduction

Die wunderschön gekennzeichnet Drosophila larvalen neuromuskulären (NMJ) glutamatergen Synapse Modell hat Untersuchung Synapse Bildung und Funktion mit einem weiten Spektrum von genetische Störungen1verwendet. Das Motoneuron-Terminal besteht aus mehreren Axon Verzweigungen, jeweils mit vielen erweiterten synaptischen Boutons. Diese geräumigen Krampfadern (bis zu 5 µm im Durchmesser) enthalten alle die Neurotransmission Maschinen, einschließlich einheitliche glutamatergen synaptischen Vesikel (SVs; ~ 40 nm im Durchmesser) in cytosolischen Reserve und leicht lösbaren Becken2. Diese Bläschen dock an der präsynaptischen Membran Fusion Website aktive Zonen (AZs), wo Exozytose die Glutamat-Neurotransmitter-Freigabe für Trans vermittelt-synaptische Kommunikation. Anschließend werden die SVs für wiederholte Exo/Endozytose Zyklen aus der Plasmamembran über recycling-Kiss-and-Run oder Clathrin-vermittelte Endozytose (CME) abgerufen. Die Drosophila NMJ ist leicht zugänglich und gut geeignet für Isolierung und Charakterisierung von SV Zyklus Mutanten. Mit vorwärts genetischer Bildschirme, führten neue Mutationen zur Identifizierung neuer Gene entscheidend für die SV-Zyklus3. Darüber hinaus haben reverse gentechnische Ansätze beginnend mit bereits bekannten Genen, die Aufklärung des neuen SV-Zyklus-Mechanismen durch die sorgfältige Beschreibung der Mutant Radfahren Phänotypen4geführt. Die Drosophila NMJ ist nahezu ideal als experimentelle synaptischen Vorbereitung für SV Endozytose und Exozytose Mechanismen über Methoden, um optisch Track Vesikel Radfahren während Neurotransmission sezieren.

Eine Reihe von fluoreszierenden Marker ermöglichen visuelle Verfolgung von Vesikeln während des Radfahrens Dynamik, aber das vielseitigste sind FM-Farbstoff-Analoga, die zuerst von Mao, F., Et al.synthetisiert wird. 5. strukturell FM Farbstoffe enthalten einen hydrophilen Kopf und einen lipophilen Schweif, verbunden durch einen aromatischen Ring mit einem Mittelbereich spektrale Eigenschaften verleihen. Diese Styryl Farbstoffe in Membranen reversibel zu partitionieren, nicht “flip-flop” zwischen Membran Flugblätter und so sind nie frei in das Zytosol, und sind weit mehr fluoreszierend in Membranen als Wasser5. Reversible Einfügung in ein Lipid Bilayer bewirkt eine 40-fold Fluoreszenz-6. Bei neuronalen Synapsen bestehen classic FM Farbstoff Kennzeichnung Experimente aus Baden die synaptische Vorbereitung mit dem Farbstoff während depolarisierende Stimulation Farbstoff über SV Endozytose geladen. Externen Farbstoff ist dann weggespült und der SV-Zyklus ist ein Kalzium-freien Ringer-Lösung geladen Synapsen7Image verhaftet. Eine zweite Runde der Stimulation in einem Farbstoff-frei Bad löst FM durch Exozytose, ein Prozess, der verfolgt werden kann, durch die Messung der Fluoreszenz Intensität verringern. SV-Populationen aus einem einzigen vesikels zu Pools mit Hunderten von Vesikeln können quantitativ überwachten6,7sein. FM-Farbstoffe wurden aktivitätsabhängige Mobilisierung von funktionell unterschiedliche SV-Pools zu sezieren, und Kiss-and-Run vs. Radfahren8,9CME vergleichen verwendet. Die Methode wurde geändert, um separat Assay hervorgerufen, spontane und Miniatur synaptischen Zyklus Aktivitäten (mit hochsensiblen Geräten sehr kleine Fluoreszenz Veränderungen erkennen und reduzieren Immunofluoreszenz)10. Assays der Ultrastrukturforschung Ebene durch Photoconverting das Fluoreszenzsignal FM in ein Elektron-Dichte Label für Transmission Electron Microscopy11,12,13,14 erweiterbar auf .

Historisch, Baden synaptischen Vorbereitungen in einer hohen Konzentration von Kalium (nachstehend als “hoch [K+]” genannt) wurde die Methode der Wahl für depolarisierende Stimulation um SV Radfahren induzieren; von der Frosch cholinerge NMJ-5, bis hin zu kultiviert Nagetier Gehirn hippocampal Neuronen15, bis die Drosophila glutamatergen NMJ Modell16,17. Dieser hohe [K+] Ansatz ist einfach, erfordert keine spezielle Ausrüstung und ist daher für die meisten Labors zugänglich, aber hat Einschränkungen für die Anwendung und Interpretation der Daten. Eine viel mehr physiologisch angemessene Methode ist mit Saug-Elektrode elektrische Stimulation des Nervs4,5,12. Dieser Ansatz treibt Aktionspotential Vermehrung zur direkten Stimulation des Nervus präsynaptischen terminal und Ergebnisse können direkt gegenüber elektrophysiologische Tests der Neurotransmission Funktion13,14, 15, sondern erfordert spezialisierte Ausrüstung und ist technisch wesentlich schwieriger. Mit dem Aufkommen der optogenetik hat die Verwendung von Channelrhodopsin neuronale Stimulation zusätzliche Vorteile, einschließlich enge räumlich-zeitliche Begrenzung der Kanal-Ausdruck mit Hilfe der binären Gal4/UAS-System20. Dieser Ansatz ist technisch einfacher als Saug-Elektrode Stimulation und erfordert nichts weiter als eine sehr billige LED-Lichtquelle. Hier beschäftigen wir Bildgebung FM1 / 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridiniumdichromat Dibromide) zu sowohl vergleichen und diese drei verschiedenen stimulationsmethoden bei Drosophila NMJ: einfach hoch [K+ ], anspruchsvolle Elektro- und neue Channelrhodopsin Ansätze.

Protocol

1. Larvenstadium Kleber Dissektion Mischen Sie 10 Teile des Silikon-Elastomer-Basis mit 1 Teil des Silikon-Elastomer Härtemittel aus Elastomer-Kit (Table of Materials). 22 x 22 mm Glasdeckgläser mit Elastomer und Heilung auf einer heißen Platte bei 75 ° c für mehrere Stunden (bis nicht mehr klebrig anfühlen) zu beschichten. Legen Sie ein einziges Elastomer-beschichtete Glas-Deckglas in maßgeschneiderte Plexi Glas Dissektion Kammer (Abbildung 1</st…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf für die aktivitätsabhängige FM Farbstoff imaging-Protokoll. Das Experiment beginnt immer mit der gleichen Larven Kleber Dissektion, unabhängig von der Stimulation Methode anschließend verwendet. Abbildung 1a zeigt eine schematische Darstellung des sezierten Larve, die ventrale Nerv Schnur (VNC), ausstrahlenden Nerven und wiederholte Hemisegmental Muskel Muster. Das VNC wird entfernt und di…

Discussion

Hoch [K+] saline depolarisierende Stimulation ist bei weitem die einfachste der drei Optionen für aktivitätsabhängige FM Farbstoff Radfahren, aber wahrscheinlich die wenigsten physiologischen29. Diese einfache Methode erschüttert jeden zugänglich Zelle in das gesamte Tier und so erlaubt keine gezielte Studien. Es kann möglich sein, lokal hohe [K+] Kochsalzlösung mit einer Mikropipette gelten, aber dies wird noch depolarisieren Pre/postsynaptischen Zellen und wahrschein…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Broadie Lab Mitgliedern für Beiträge zu diesem Artikel. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R01s MH096832 und MH084989, k.b., und NIH predoctoral Fellowship F31 MH111144, D.L.K.

Materials

SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22×22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity
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FM DyeSynaptic Vesicle CyclingNeuromuscular JunctionDrosophila LarvaeHigh Potassium DepolarizationElectrical StimulationOptogeneticsAnti-HRP AntibodyElastomer-coated CoverslipDissectionGluingMotor NerveCalcium-free SalineSuction PipetteMicroelectrode PullerMicro ForgeMicromanipulator
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Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).
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