Identificação de marcadores de virulência de Mycobacterium abscessus para replicação intracelular em fagócitos

Summary

Aqui, apresentamos dois protocolos para estudar interações do fagócito -Mycobacterium abscessus : a triagem de uma biblioteca de transposon mutant para deficiência intracellular bacteriana e a determinação de bactérias intracelular transcriptoma do RNA sequenciamento. Ambas as abordagens fornecem insights sobre as vantagens genômicas e adaptações de transcriptomic melhorar a aptidão de bactérias intracelulares.

Abstract

O que diferencia outras micobactérias saprófitas Mycobacterium abscessus é a capacidade de resistir a fagocitose por macrófagos humanos e a capacidade de se multiplicar no interior dessas células. Essas características de virulência processam M. abscessus patogênicos, especialmente em hosts vulneráveis com doença pulmonar estrutural subjacente, como fibrose cística, Bronquiectasia ou tuberculose. Como a doentes infectados com M. abscessus permanece obscuro. Ao contrário de muitos micobactérias, M. abscessus não é encontrado no ambiente, mas pode residir dentro as amebas, fagócitos ambientais que representam um potencial reservatório para M. abscessus. Com efeito, M. abscessus é resistente à fagocitose amoebal e a vida intra-ameba parece aumentar a virulência do M. abscessus em um modelo experimental de infecção. No entanto, pouco é conhecido sobre a virulência do M. abscessus em si. Para decifrar os genes que conferem uma vantagem para M. abscessus vida intracelular, uma triagem de uma biblioteca de mutante de transposon M. abscessus foi desenvolvida. Em paralelo, foi desenvolvido um método de extração de RNA de micobactérias intracelulares após co-cultura com amebas. Este método foi validado e permitiu o sequenciamento de todo M. abscessus transcriptomes no interior das células; fornecimento, pela primeira vez, uma visão global para M. abscessus adaptação à vida intracelular. Ambas as abordagens dão-em uma visão M. abscessus fatores de virulência que permitem a M. abscessus colonizar as vias aéreas em seres humanos.

Introduction

O gênero Mycobacterium inclui espécies que variam de organismos saprófitas inofensivos a principais patógenos humanos. Espécies patogénicas well-known tais como Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum e Mycobacterium ulcerans pertencem ao subgrupo de crescimento lento micobactérias (SGM). Em contraste, o subgrupo de rápido crescimento micobactérias (RGM) caracteriza-se pela sua capacidade de formar colônias visíveis em menos de 7 dias em ágar-ágar. O grupo RGM abrange mais de 180 espécies, principalmente de não-patogênicas micobactérias saprófitas. Estudos sobre RGM as interações com seus hospedeiros principalmente focado na My....

Protocol

1. Biblioteca triagem

1. Construção da biblioteca mutante Tn
   1. Obter uma biblioteca de transposon.
      Nota: Para este experimento, uma biblioteca de transposon mutant foi obtida E.J. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, EUA. A biblioteca foi construída de uma suave tensão clínica (43S) da M. abscessus complexo (M. abscessus subsp. massiliense) com um phagemid introduzido por M. abscessus , permitindo a inserção aleatória de um único Tn em um dinucleótido de TA (91.240 sequências de TA no genoma de M. abscessus ). Para mais detalhes, consulte referência de Rubin

Results

M. abscessus tem a capacidade de resistir e fugir das respostas bactericidas de macrófagos e ambientais protozoários como as amebas. M. abscessus expressa fatores de virulência quando cultivada em contacto com as amebas, que o torna mais virulento em ratos⁴. O primeiro objetivo desses métodos era identificar os genes presentes no M. abscessus , permitindo sua sobrevivência e multiplicação dentro de amebas.

Discussion

O comportamento de M. abscessus é muito mais semelhante ao comportamento da SGM patogénico, tais como M. tuberculosis do que qualquer outras micobactérias pertencentes a RGM². O elemento chave na patogenicidade de SGM é sua capacidade de sobreviver ou até mesmo se multiplicam dentro de células apresentadoras de antígeno, tais como macrófagos e células dendríticas.

M. abscessus adquiriu certas vantagens genômicas como mostrado pela sequência to.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do Material/ Equipamentoplacas de
24 poços	Thermofisher	11874235
placas de 96 poços	Thermofisher	10687551
Beadbeater	Bertin	Precellys 24
Bioanalyzer	Agilent
Genepulser Xcell	Biorad
Nanodrop espectrofotômetro 2000	Thermofisher
QuBit fluorômetro	Thermofisher	Q33226
grânulos de zircônio / grânulos de sílica	Produtos Biospec	11079101Z	Grânulos
Nome do reagente/células
Acanthamoeba  Castellanii	ATCC	30010	cepa
Amikacin	Mylan	150927-A	pó
B-mercaptoetanol	Solução Sigma-Aldrich	M6250
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016	>93% clorofórmio anidro granular
nbsp;	Enzima Fluka	25666	solution
ClaI Enzima	New England Biolabs	R0197S
Ágar Columbia	Biomerieux	43041	90 mm
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	pó
DMEM	Thermofisher	11500596	água livre de
DNase e RNase média	Invitrogen	10977-035	solution
E.  coli eletrocompetente	Thermofisher	18265017	bactérias
EDTA	Sigma-Aldrich	E4884	em pó
Escherichia coli	Bactérias isoladas clínicas	Fe
(NH4)2(SO4)-6H20	EMS	15505-40	solução de sulfato 4% aquosa
Soro fetal de bezerro	Gibco	10270	soro
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	solução
tiocianato de guanídio	Euromedex	EU0046-D	pó
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516	solução
J774.2 macrófagos	Sigma-Aldrich	J774.2	Cepa
kanamicina	Sigma-Aldrich	60615	pó
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	Monobásico, meio
líquido anidro LB	Invitrogen	12795-027	pó
Lisozima	Roche	10837059001	pó
MgSO4	Labosi	M275	pur
Microbank TM (criotubos com contas)	Pro-Lab Diagnostic	PL.170/M
Middlebrook 7H11 médio	Sigma-Aldrich	M0428	pó
Middlebrook 7H9 médio	Thermofisher	11753473	pó
Mü ágar ller-Hinton	Biorad	3563901	pó
N-Lauril-sarcosina	Merck	S37700 416	pó
Na2HPO4-7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	98-102%
Fenol/clorofórmio	Solução Sigma-Aldrich	77617
Proteinase K	Thermofisher	EO0491	proteose peptone
	em pó BD	211684	digestão enzimática de tecido animal
plasmídeo pUC19	New England Biolabs	54357	plasmídeo
SDS  20%	Biorad	solução	1610418
Citrato de sódio	Calbiochem	567446	pó
Thiourea	Sigma-Aldrich	88810	pó
Tris	Sigma-Aldrich	154563	pó
Trizol	de 12044977		Thermofisher
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754	solução
Extrato de levedura	BD	212750
Kit
AMBION DNase kit	Kit	de 10792877	Thermofisher
DNA Agilent Chip	Agilent	5067-1504
kit GeneJET Plasmid Miniprep kit	Kit Thermofisher	K0503
Kit de purificação PureLink PCR	Kit	de K310001	Invitrogen
Kit de ensaios Quant-It"	Kit de ensaios Thermofisher	Q33140/Q32884
T4 DNA ligase	Kit Invitrogen	Y90001
Kit de preparação TruSeq Stranded RNA LT	Kit	de 15032611	Illumina