Kvantifiera Vibriocholerae koloniseringen och diarré hos vuxna zebrafisk modellen
Summary
Zebrafisk är en naturlig Vibriocholerae värd och kan användas för att sammanfatta och studera hela smittsamma cykeln från kolonisationen till överföring. Här visar vi hur du bedöma V. cholerae colonization nivåer och kvantifiera diarré hos zebrafiskar.
Abstract
Vibriocholerae är känd som det smittämne som orsakar den mänskliga sjukdomen kolera. Utanför den mänskliga värden finns V. cholerae främst i vattenmiljön, där det interagerar med en mängd högre vattenlevande arter. Ryggradsdjur fisk är kända för att vara en miljö värd och är en potentiell V. cholerae reservoar i naturen. Både V. cholerae och de lever fiskarter Danio rerio, allmänt känd som zebrafisk, påbörjar från den indiska subkontinenten, vilket tyder på en långvarig interaktion i vattenmiljöer. Zebrafisk är en ideal modellerar organism för att studera många aspekter av biologi, inklusive infektionssjukdomar. Zebrafiskar kan vara enkelt och snabbt koloniserats av V. cholerae efter exponering i vatten. Intestinal koloniseringen av V. cholerae leder till produktion av diarré och utsöndring av replikerade V. cholerae. Dessa utsöndras bakterier kan sedan gå på att kolonisera nya fisk-värdarna. Här visar vi hur du bedöma V. cholerae-intestinal kolonisationen i zebrafiskar och hur att kvantifiera V. cholerae-inducerad zebrafiskar diarré. Colonization modellen bör vara användbart för forskare som studerar om gener av intresse kan vara viktigt för värd koloniseringen och/eller miljömässiga överlevnad. Kvantifiering av zebrafisk diarré bör vara användbar för forskare som studerar någon intestinal patogen som är intresserade av att utforska zebrafiskar som modellsystem.
Introduction
Vibriocholerae är en vattenlevande, gramnegativ bakterie som orsakar den mänskliga sjukdomen kolera liksom sporadiska diarré1,2. V. cholerae återfinns i miljön i många områden av världen, ofta i samband med andra vattenlevande organismer. Dessa förbindande organismer omfattar plankton, insekter ägg massorna, skaldjur och ryggradsdjur fisk arter3,4,5,6,7. Flera studier har isolerat V. cholerae från de intestinala skrifter av fisk i olika geografiska områden7,8,9,10. Förekomsten av V. cholerae i fisk visar att fisk kan fungera som en miljömässig reservoar. Fisk kan också vara inblandad i överföra sjukdomen till människor och i den geografiska fördelningen av V. cholerae stammar6.
För att bättre förstå hur V. cholerae samverkar med fisk, utvecklades Danio rerio, bättre känd som zebrafisk, som modellsystem för att studera V. kolerae11. Zebrafisk är infödda till södra Asien, inklusive bengaliska regionen, som tros vara den tidigaste reservoaren av V. cholerae. Före första kolera pandemin början 1817 hade kolera inte rapporterats utanför vad som nu är Indien och Bangladesh. Därför zebrafiskar och V. cholerae nästan säkert samband med varandra över evolutionära tidsskalor, tyder på att zebrafiskar är en V. cholerae värd i naturlig miljö12.
Zebrafisk modellen för V. cholerae är enkel att köra och kan användas för att studera hela patogena V. cholerae livscykel. Fisken exponeras för V. cholerae av badning i vatten som har varit inokuleras med ett känt antal av V. cholerae. Inom några timmar sker intestinal colonization, följt av produktionen av diarré. Diarré består av mucin, proteiner, utsöndrade bakterier och andra tarminnehållet. Graden av diarré kan kvantifieras med hjälp av några enkla mätningar13. V. cholerae som har varit utsöndras av infekterade fisk kan sedan gå att infektera naiva fisk, att fylla den smittsamma cykeln. Därför, zebrafisk modellen recapitulates V. cholerae mänskliga sjukdomar process12,14.
Till de vanligaste V. cholerae djurmodeller har historiskt möss och kaniner14,15,16,17,18. Dessa modeller har varit avgörande för att lägga till vår kunskap om V. cholerae patogenes. Men eftersom möss och kaniner inte är naturliga V. cholerae värdar, det finns begränsningar för vilka aspekter av V. cholerae livscykel kan studeras. V. cholerae koloniseringen av möss och kaniner kräver normalt avsaknad av tarmens bakterieflora eller en förbehandling med antibiotika till skador i tarmens bakterieflora. Båda modellerna kräver antingen sondmatning införa bakterier till mag-tarmkanalen eller kirurgisk manipulation att direkt injicera bakterierna i tarmen. Zebrafisk har en fördel i att vuxna fiskar med en intakt tarmens bakterieflora är lätt koloniserade och smittsamma processen sker naturligt utan någon manipulation som krävs.
Detta arbete visar att utnyttja zebrafiskar som modell i V. cholerae infektion. Smittan, dissektion, uppräkning av kolonisera V. choleraeoch kvantifiering av diarré orsakad av V. cholerae blir beskrivna12,13. Denna modell är sannolikt att vara till nytta för forskare som är intresserade av både sjukdomsprocessen V. cholerae och V. cholerae miljömässiga livsstil.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafiskar är en relativt ny modell för att studera V. cholerae men rymmer mycket löfte för framtida upptäckten av tidigare okända aspekter av V. cholerae biologi och patogenes11,12,13 . Adult zebrafisk modellen har fördelar av att vara både en naturlig V. cholerae värd som innehåller intakt, Mogen tarmens bakterieflora och miljömässiga modellen. Nackdelarna med modellen är att de två st…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tack vare Melody Neely, Jon Allen, Basel Abuaita och Donna Runft för deras ansträngningar att hjälpa att utveckla zebrafisk modellen. Den forskning som redovisas här stöddes av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar av det nationella Institutes of Health under award nummer R21AI095520 och R01AI127390 (till Jeffrey H. Withey). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Materials
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
Referências
- Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
- Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
- Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
- Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
- Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40 (2001).
- Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
- Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).
- Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
- Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
- Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
- Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
- Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn, H., Sprinz, Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
- Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
- Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
- Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
- Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff’s reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
- Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
- Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).
