Kwantificeren van de kolonisatie van Vibrio cholerae en diarree in het volwassen Zebrafish Model
Summary
Zebravis zijn een natuurlijke Vibrio cholerae host en kan worden gebruikt om te recapituleren en de studie van de gehele besmettelijke cyclus van kolonisatie tot transmissie. Hier laten we zien hoe V. cholerae kolonisatie niveaus beoordelen en kwantificeren van diarree in zebrafish.
Abstract
Vibrio cholerae is het best bekend als het infectieuze agens dat ervoor zorgt dat de cholera van ziekten bij de mens. Buiten de menselijke gastheer bestaat V. cholerae hoofdzakelijk in het aquatisch milieu, waar deze met een scala aan hogere aquatische soorten samenwerkt. Gewervelde vis bekend is dat ze een milieu host en een potentiële V. cholerae reservoir in de natuur zijn. Zowel V. cholerae en de teleost vissoorten Danio rerio, kortweg zebrafish, zijn afkomstig uit het Indiase subcontinent, suggereren een langdurige interactie in aquatische milieus. Zebravis zijn een ideale modelorganisme voor het bestuderen van vele aspecten van de biologie, met inbegrip van besmettelijke ziekten. Zebrafish kan worden gemakkelijk en snel gekoloniseerd door V. cholerae na blootstelling in water. Intestinale kolonisatie door V. cholerae leidt tot de productie van diarree en de uitscheiding van gerepliceerde V. cholerae. Deze bacteriën kunnen uitgescheiden dan gaan koloniseren nieuwe vis hosts. Hier, laten we zien hoe te beoordelen V. cholerae-intestinale kolonisatie in zebrafish en hoe te kwantificeren V. cholerae-geïnduceerde zebrafish diarree. De kolonisatie-model moet zinvol zijn voor onderzoekers die studeren of genen van belang belangrijk voor de kolonisatie van de gastheer en/of milieu overleven zijn kunnen. De kwantificering van de zebravis diarree moet zinvol zijn voor onderzoekers bestuderen van een intestinale pathogenen die geïnteresseerd zijn in het verkennen van de zebravis als modelsysteem.
Introduction
Vibrio cholerae is een aquatische, gram-negatieve bacterie, waardoor de cholera van ziekten bij de mens, alsmede de sporadische diarree1,2. V. cholerae wordt gevonden in het milieu in veel gebieden van de wereld, vaak geassocieerd met andere aquatische organismen. Deze associëren organismen bevatten plankton, insecten ei massa’s, schelpdieren en vis van de gewervelde soorten3,4,5,6,7. Verschillende studies hebben geïsoleerd V. cholerae uit de intestinale stukken vis in verschillende geografische gebieden7,8,9,10. De aanwezigheid van V. cholerae in vis geeft aan dat de vis als een milieu reservoir optreden kan. Vis kan ook betrokken worden in het overbrengen van de ziekten bij de mens en in de geografische verspreiding van V. cholerae stammen6.
Om beter te begrijpen hoe V. cholerae samenwerkt met vis, werd Danio rerio, beter bekend als zebrafish, ontwikkeld als een modelsysteem voor het bestuderen van V. cholerae11. Zebravis zijn inheems in Zuid-Azië, met inbegrip van de Golf van Bengalen regio, die wordt beschouwd als de vroegste reservoir van V. cholerae. Vóór de eerste cholera pandemie begin in 1817, had niet cholera gemeld buiten wat nu India en Bangladesh. Daarom, zebravis en V. cholerae vrijwel zeker in verband met elkaar over evolutionaire tijdschema’s, suggereren dat zebrafish zijn een V. cholerae host in de natuurlijke omgeving12.
De zebravis model voor V. cholerae is eenvoudig uit te voeren en kan worden gebruikt voor het bestuderen van de gehele pathogene V. cholerae levenscyclus. Vissen worden aan V. cholerae door zwemmen in water dat heeft zijn geënt met een bekend aantal V. choleraeblootgesteld. Binnen een paar uur plaatsvindt intestinale kolonisatie, gevolgd door de productie van diarree. Diarree bestaat uit mucin, eiwitten, uitgescheiden bacteriën en andere intestinale inhoud. De mate van diarree kan worden gekwantificeerd aan de hand van een paar eenvoudige metingen13. V. cholerae die heeft zijn uitgescheiden door besmette vis kan vervolgens verder te infecteren naïef vis, completeren de besmettelijke cyclus. Daarom is het model van de zebravis recapituleert de V. cholerae ziekten bij de mens proces12,14.
De meest gebruikte V. cholerae diermodellen geweest historisch muizen en konijnen14,15,16,17,18. Deze modellen hebben bijgedragen in toe te voegen aan onze kennis van V. cholerae pathogenese. Echter omdat muizen en konijnen niet natuurlijke V. cholerae zijn gastheren, er zijn beperkingen aan welke aspecten van de levenscyclus V. cholerae kunnen worden bestudeerd. De kolonisatie V. cholerae van muizen en konijnen vereist normaliter de afwezigheid van intestinale microbiota of een voorbehandeling met antibiotica om schade van de intestinale microbiota. Beide modellen vereisen maagsonde in te voeren van de bacteriën om het spijsverteringskanaal of chirurgische manipulatie om direct het injecteren van de bacteriën in de darmen. Zebravis hebben een voordeel in dat volwassen vis met een intact intestinale microbiota gemakkelijk zijn gekoloniseerd en het besmettelijke proces gebeurt natuurlijk zonder iedere manipulatie vereist.
Het huidige werk demonstreert het gebruik van de zebravis als model in V. cholerae infectie. De infectie, dissectie, opsomming van kolonisatie V. choleraeen de kwantificering van diarree veroorzaakt door V. cholerae zullen beschreven12,,13. Dit model is waarschijnlijk nuttig voor wetenschappers geïnteresseerd in het ziekteproces V. cholerae zowel in de ecologische levensstijl V. cholerae .
Protocol
Representative Results
Discussion
De zebravis is een relatief nieuw model voor het bestuderen van V. cholerae maar houdt veel belofte voor de toekomstige ontdekking van voorheen onbekende aspecten van V. cholerae biologie en pathogenese11,12,13 . De volwassen zebrafish model heeft de voordelen van beide een natuurlijke V. cholerae host die intact, volwassen intestinale microbiota en een milieu-model bevat. Nadelen van het model zijn da…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dankzij het Melody Neely, Jon Allen, Basel Abuaita en Donna Runft voor hun inspanningen bij het ontwikkelen van de zebravis model. Het onderzoek hier gemeld werd gesteund door de National Institute of Allergy and Infectious Diseases van de National Institutes of Health onder award nummers R21AI095520 en R01AI127390 (voor Jeffrey H. Withey). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
Referências
- Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
- Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
- Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
- Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
- Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40 (2001).
- Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
- Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).
- Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
- Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
- Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
- Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
- Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
- Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn, H., Sprinz, Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
- Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
- Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
- Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
- Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff’s reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
- Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
- Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).
