Zebrafish são um natural Vibrio cholerae hospedar e pode ser usado para recapitular e estudar o ciclo infeccioso de colonização para transmissão. Aqui, demonstramos como V. cholerae níveis de colonização de avaliar e quantificar a diarreia no zebrafish.
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Artigo de método
Quantificar a colonização de Vibrio cholerae e diarreia no adulto modelo de Zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
Vibrio cholerae é conhecido como o agente infeccioso que causa a cólera de doenças humanas. Fora do hospedeiro humano, V. cholerae principalmente existe no ambiente aquático, onde interage com uma variedade de espécies aquáticas superiores. Vertebrados peixes são conhecidos por serem um host ambiental e são um reservatório potencial de V. cholerae na natureza. Tanto V. cholerae e as espécies de peixes teleósteos Danio rerio, comumente conhecidas como peixe-zebra, originam o subcontinente indiano, sugerindo uma interação de longa data em ambientes aquáticos. Zebrafish são um organismo modelo ideal para estudar muitos aspectos da biologia, incluindo doenças infecciosas. Zebrafish pode ser facilmente e rapidamente colonizado por V. cholerae após exposição na água. Colonização intestinal por V. cholerae leva à produção de diarreia e a excreção de replicada V. cholerae. Estas excretada bactérias pode, em seguida, vão para colonizar novos hospedeiros de peixe. Aqui, demonstramos como avaliar V. cholerae-colonização intestinal no zebrafish e como quantificar V. cholerae-induzida do zebrafish diarreia. O modelo de colonização deve ser útil para pesquisadores que estão estudando se os genes de interesse podem ser importantes para a colonização do hospedeiro e/ou de sobrevivência ambiental. A quantificação do zebrafish diarreia deve ser útil para pesquisadores estudando qualquer patógeno intestinal que estão interessados em explorar o zebrafish como um sistema modelo.
Introdução
Vibrio cholerae é uma bactéria Gram-negativa aquática que provoca a cólera de doenças humanas, bem como diarreia esporádica1,2. V. cholerae é encontrado no ambiente em muitas áreas do globo, muitas vezes associado com outros organismos aquáticos. Estes organismos associados incluem plâncton, massas de ovos de insetos, moluscos e vertebrados peixes espécie3,4,5,6,7. Vários estudos têm isolado V. cholerae do trato intestinal....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Wayne State University. Esse método foi descrito pela primeira vez em Runft et al . 12
1. determinação dos níveis de colonização Intestinal
Nota: Colonização Intestinal é a métrica mais útil no modelo de zebrafish como ele pode ser usado para comparar a adequação relativa de diversas variedades de V. cholerae ou os efeitos de mutações ou nocautes de gene.
- Inoculação de zebrafish por imersão
Nota: Este meio de exposição asse....
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Resultados
V. cholerae colonização do trato intestinal de zebrafish
Para fornecer um exemplo dos níveis típicos de colonização que observamos, nós inoculado 5 x 106 UFC da pandemia EL Tor V. cholerae estirpe N16961 em 200 mL de água numa proveta contendo vários zebrafish. Após 6 h de infecção, os peixes foram lavados em água doce e transferidos para um copo de 200 mL de água esterilizada infecção conforme descrito.......
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Discussão
O peixe-zebra é um modelo relativamente novo para o estudo V. cholerae , mas é uma grande promessa para a futura descoberta de aspectos anteriormente desconhecidos de V. cholerae biologia e patogênese11,12,13 . O modelo de zebrafish adulto tem as vantagens de ser ambos um natural V. cholerae host que contém microbiota intestinal intacta, madura e um modelo ambiental. Desvantagens do modelo são que os d.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Graças a melodia Neely, Jon Allen, Abuaita de Basileia e Donna Runft por seus esforços em ajudar a desenvolver o modelo de zebrafish. A pesquisa relatada aqui foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas do institutos nacionais da saúde sob números do prêmio R21AI095520 e R01AI127390 (para Jeffrey H. Withey). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Instrument | |||
| Shaker incubadora | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubadora | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogeneizador | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Máquina de pesagem | Ohaus, Columbia, MD | Agitador de calor Adventurer Pro | |
| Corning, Corning, NY | PC-420D | ||
| Contador de colônias automatizado | de | ||
| Materiais | |||
| tampas perfuradas | Suporte Microtip com furos da caixa | ||
| colheres de plástico descartáveis | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Sistema de tanque de peixes | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Purificador de água Aqua | FX | TK001 | |
| Rede de peixes | Marina | ||
| comida de peixe | Tetra fin | ||
| Camarão Salmoura | Selva vermelha marca | O.S.I. pro 80 | |
| Placa | |||
| Pinos | |||
| Bisturis | Ferramentas Fine Scientific, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Fórceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Tesoura Vannas | Fine Scientific ferramentas, Foster City, CA | 15000-11 | |
| Tubos com tampa de rosca de 2 ml | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| Contas de vidro de 1 mm | Bio Spec | 11079110 | |
| Contas de vidro para espalhar | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Placa de Petri | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| Tubo de centrífuga de 1,5 ml | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 Tubo | |
| de centrífuga de 50 ml | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Tubos de teste | Pipeta de vidro Pyrex | 9820 | |
| Marca | Fisher, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipetas | Sartorius Biohit, Gö ttingen, Alemanha | m1000/m200/m20 | |
| Dicas | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered shal | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (etil 3-aminobenzoato de metanossulfonato sal | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff ' s reagente | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| de ácido periódico | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucina de estômago suíno | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Albumina de soro bovino | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB médio | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Extrato de Leste | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Ágar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| Ágar | TCBSBD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft Office | |||
| Prism 5 |
Referências
- Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
- Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (201....
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Reimpressões e permissões
