Quantificar a colonização de Vibrio cholerae e diarreia no adulto modelo de Zebrafish
Summary
Zebrafish são um natural Vibrio cholerae hospedar e pode ser usado para recapitular e estudar o ciclo infeccioso de colonização para transmissão. Aqui, demonstramos como V. cholerae níveis de colonização de avaliar e quantificar a diarreia no zebrafish.
Abstract
Vibrio cholerae é conhecido como o agente infeccioso que causa a cólera de doenças humanas. Fora do hospedeiro humano, V. cholerae principalmente existe no ambiente aquático, onde interage com uma variedade de espécies aquáticas superiores. Vertebrados peixes são conhecidos por serem um host ambiental e são um reservatório potencial de V. cholerae na natureza. Tanto V. cholerae e as espécies de peixes teleósteos Danio rerio, comumente conhecidas como peixe-zebra, originam o subcontinente indiano, sugerindo uma interação de longa data em ambientes aquáticos. Zebrafish são um organismo modelo ideal para estudar muitos aspectos da biologia, incluindo doenças infecciosas. Zebrafish pode ser facilmente e rapidamente colonizado por V. cholerae após exposição na água. Colonização intestinal por V. cholerae leva à produção de diarreia e a excreção de replicada V. cholerae. Estas excretada bactérias pode, em seguida, vão para colonizar novos hospedeiros de peixe. Aqui, demonstramos como avaliar V. cholerae-colonização intestinal no zebrafish e como quantificar V. cholerae-induzida do zebrafish diarreia. O modelo de colonização deve ser útil para pesquisadores que estão estudando se os genes de interesse podem ser importantes para a colonização do hospedeiro e/ou de sobrevivência ambiental. A quantificação do zebrafish diarreia deve ser útil para pesquisadores estudando qualquer patógeno intestinal que estão interessados em explorar o zebrafish como um sistema modelo.
Introduction
Vibrio cholerae é uma bactéria Gram-negativa aquática que provoca a cólera de doenças humanas, bem como diarreia esporádica1,2. V. cholerae é encontrado no ambiente em muitas áreas do globo, muitas vezes associado com outros organismos aquáticos. Estes organismos associados incluem plâncton, massas de ovos de insetos, moluscos e vertebrados peixes espécie3,4,5,6,7. Vários estudos têm isolado V. cholerae do trato intestinal de peixes em diferentes zonas geográficas7,8,9,10. A presença de V. cholerae em peixes indica que o peixe pode atuar como um reservatório ambiental. Peixes também poderiam ser implicados na transmissão da doença aos seres humanos e na disseminação geográfica de V. cholerae estirpes6.
Para entender melhor como o V. cholerae interage com peixe, Danio rerio, mais conhecido como peixe-zebra, foi desenvolvido como um sistema modelo para estudar V. cólerae11. Zebrafish são nativas do Sul da Ásia, incluindo a região da Baía de Bengala, que é pensado para ser o mais antigo reservatório de V. cholerae. Antes do início primeiro cólera pandemia, em 1817, a cólera não tinha sido relatada fora do que é hoje a Índia e Bangladesh. Portanto, zebrafish e V. cholerae quase certamente associado com o outro em escalas de tempo evolutivo, sugerindo que zebrafish são uma série de V. cholerae no ambiente natural12.
O modelo de zebrafish para o V. cholerae é simples de executar e pode ser usado para estudar a patogenicidade de todo o ciclo de vida V. cholerae . Peixes são expostos para o V. cholerae por tomar banho na água que tenha sido inoculado com um número conhecido de V. cholerae. Dentro de algumas horas, colonização intestinal ocorre, seguido pela produção de diarreia. Diarreia consiste de mucina, proteínas, bactérias excretadas e outro conteúdo intestinal. O grau de diarreia pode ser quantificado usando algumas medições simples13. V. cholerae que tem sido excretado pelos peixes infectados pode então ir para infectar os peixes ingênuo, completando o ciclo infeccioso. Portanto, o modelo de zebrafish recapitula o V. cholerae doença humana processo12,14.
O mais frequentemente usado V. cholerae modelos animais têm sido, historicamente, ratos e coelhos14,15,16,17,18. Esses modelos têm sido fundamentais para adicionar ao nosso conhecimento de V. cholerae patogênese. No entanto, porque os ratos e coelhos não são naturais V. cholerae anfitriões, existem limitações a que aspectos do ciclo de vida V. cholerae podem ser estudados. A V. cholerae colonização de ratos e coelhos, normalmente, requer a ausência da microbiota intestinal ou um tratamento prévio com antibióticos para danificar a microbiota intestinal. Ambos os modelos requerem ou gavagem para introduzir as bactérias para o sistema digestivo ou manipulação cirúrgica para injetar diretamente as bactérias no intestino. Zebrafish têm uma vantagem em que peixes adultos com uma microbiota intestinal intacta prontamente são colonizados e o processo infeccioso acontece naturalmente, sem qualquer manipulação necessária.
O presente trabalho demonstra a utilização do zebrafish como modelo em V. cholerae infecção. A infecção, dissecação, enumeração de colonizar V. choleraee a quantificação de diarreia causada pelo V. cholerae será descrito12,13. Este modelo é provável que seja útil para os cientistas interessados no processo de doença V. cholerae e o V. cholerae ambiental estilo de vida.
Protocol
Representative Results
Discussion
O peixe-zebra é um modelo relativamente novo para o estudo V. cholerae , mas é uma grande promessa para a futura descoberta de aspectos anteriormente desconhecidos de V. cholerae biologia e patogênese11,12,13 . O modelo de zebrafish adulto tem as vantagens de ser ambos um natural V. cholerae host que contém microbiota intestinal intacta, madura e um modelo ambiental. Desvantagens do modelo são que…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Graças a melodia Neely, Jon Allen, Abuaita de Basileia e Donna Runft por seus esforços em ajudar a desenvolver o modelo de zebrafish. A pesquisa relatada aqui foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas do institutos nacionais da saúde sob números do prêmio R21AI095520 e R01AI127390 (para Jeffrey H. Withey). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.
Materials
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
Referências
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