Aqui, apresentamos um protocolo para permitir que a quantificação exata de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com um pipeline de análise de bioinformatic que pode ser usado para evitar a superestimação dos níveis de metilação do DNA mitocondrial causada pela estrutura secundária do DNA mitocondrial.
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Artigo de método
Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial
Neste artigo
Resumo
Resumo
Quantificação de metilação do DNA pode ser conseguida usando sequenciamento de bissulfito, que aproveita a propriedade de bissulfito de sódio para converter unmethylated citosina em uracil, num contexto single-stranded DNA. Sequenciamento de bissulfito pode ser direcionado (usando PCR) ou executadas no genoma inteiro e fornece quantificação absoluta de metilação de citosina na única base-resolução. Dada a natureza distinta de DNA nuclear e mitocondrial, nomeadamente a estrutura secundária, devem ser feitas adaptações de métodos de sequenciamento de bissulfito para investigar a metilação de citosina no DNA mitocondrial. Estrutura secundária e terciária de DNA mitocondrial de fato pode levar a bissulfito artefatos levando a falso-positivos devido a acesso de pobres incompleta desnaturação de bissulfito de ADN single-stranded de sequenciamento. Aqui, descrevemos um protocolo usando uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com pipeline de análise de bioinformatic para permitir a quantificação exata da citosina níveis de metilação no DNA mitocondrial. Além disso, podemos fornecer diretrizes para projetar os primers de sequenciamento de bissulfito específicos para DNA mitocondrial, para evitar a segmentação segmentos NUclear mitocondrial indesejáveis (NUMTs) inserido no genoma nuclear.
Introdução
O genoma mitocondrial é uma estrutura circular, double-stranded de aproximadamente 16,5 kg base (kb), constitui um pesado e um fio de luz. O genoma mitocondrial está presente em várias cópias dentro de cada célula, herdado maternalmente e codifica componentes essenciais da cadeia respiratória complexos1. Semelhantes aos genomas bacterianas e ao contrário do genoma nuclear, o genoma mitocondrial é organizado em numerosas estruturas secundárias e terciárias, como em estruturas enrolado e supercoiled2, que pode tornar o acesso difícil durante o sequenciamento experiências3.
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Protocolo
1. tratamento enzima de restrição
- Linearizar mtDNA tratando o DNA humano total com a enzima de restrição BamHI, que corta na posição 14258 no DNA mitocondrial humano.
Nota: Para mouse DNA, use a enzima de restrição BglII sob condições idênticas como abaixo. - Para cada amostra onde a metilação do DNA mitocondrial é para ser avaliado, preparar um tubo de reacção de 0,2 mL e adicionar o seguinte mistura: 3 μg DNA genômico (quantificado pelo fluorometry), 15 μL tampão 3, 3 μL BamHI e água acima de 150 μL
- Coloque os tubos em um termociclador por 4 h a 37 ° C.
2. bissulfito conversão
- Converta o DNA ....
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Resultados
Duas etapas neste protocolo são cruciais ao investigar a metilação do DNA mitocondrial. 1) a abertura da estrutura secundária e 2) o projeto de primers de específicas de DNA mitocondriais.
Digerindo o DNA genômico humano com a enzima de restrição BamHI (Figura 1), a estrutura de DNA mitocondrial será cortada no nucleotídeo posição 14.258 e estrutura secundária será aberta.
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Discussão
Aqui, nós fornecemos um protocolo de bissulfito-sequenciamento que é projetado especificamente para interrogar a metilação do DNA mitocondrial. As diferenças com bissulfito-sequenciamento protocolos usados para DNA genômico situa-se na utilização de uma enzima de restrição prévia etapa de digestão e uma análise de bioinformatic acórdão fora falsos positivos decorrentes NUMT sequências.
Nós fornecemos um protocolo para evitar artefatos de bissulfito-sequenciamento ao investigar a metilação do D.......
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Divulgações
Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes para declarar.
Agradecimentos
A Novo Nordisk Fundação Centro de pesquisa metabólica básica é um centro de pesquisa independente da Universidade de Copenhagen, parcialmente financiados por uma doação irrestrita da Novo Nordisk Foundation.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Ensaio Qubit ssDNA | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Tubos de ensaio Qubit | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq mais kit de DNA polimerase | Qiagen | # 203603 | |
| Kit de Extração de Gel QIAquick | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit para Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes para Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| Chip de DNA de Alta Sensibilidade | Agilent | # 5067-4626 | |
| Ensaio de dsDNA de alta sensibilidade | Qubit Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| Kit de reagentes MiSeq v2 300 ciclos | Illumina | # MS-102-2003 | |
| Controle PhiX v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Hidróxido de sódio | Sigma | # S5881 | |
| Termociclador C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Sistema de detecção de PCR em tempo real | Biorad | #1855195 | |
| Fluorômetro Qubit | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| Instrumento MiSeq | Illumina | # SY-410-1003 |
Referências
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A.
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Reimpressões e permissões
