Denne enkel molekyl fluorescens i situ hybridisering protokollen er optimalisert for å tallfeste antallet RNA molekyler i spirende gjær under vegetativ vekst og meiose.
Ett molekyl fluorescens i situ hybridisering (smFISH) er en kraftfull teknikk å studere genuttrykk i enkeltceller på grunn av sin evne til å oppdage og telle RNA molekyler. Utfyllende til dyp sekvensering-baserte metoder, smFISH gir informasjon om celle-til-celle variasjonen i transkripsjon overflod og den subcellular lokaliseringen av en gitt. Nylig har vi brukt smFISH å studere uttrykket av genet NDC80 under meiose i spirende gjær, i hvilke to transkripsjon isoformene finnes og kort transkripsjon isoformen har hele sekvensen delt med den lange isoformen. Trygt Finn hver utskrift isoformen, vi optimalisert kjent smFISH protokoller og høy konsistens og kvaliteten på smFISH data for prøvene ervervet under spirende gjær meiose. Her beskriver vi denne optimalisert protokollen, kriteriene som brukes for å avgjøre om høy kvalitet smFISH data hentes, og noen tips for å implementere denne protokollen i andre gjær påkjenningen og vekst betingelser.
Dynamisk regulering av genuttrykk kjører utviklingen av en organisme, samt sitt svar på miljøstress, infeksjon og endringer i metabolisme. Studier som fokuserer på transcriptional regulering avhengige teknologier som måler RNA overflod. En slik metode, kalt ett molekyl fluorescens i situ hybridisering (smFISH), brukes for påvisning av RNA molekyler i enkeltceller1,2. Denne metoden tillater måling av celle-til-celle variasjon i genuttrykk og fastsetting av intracellulær RNA lokalisering.
Det mest brukte smFISH teknikken krever oppdagelsen av en individuell RNA molekylet flere kort DNA sonder (ofte ~ 48 20-mer sonder) som er komplementære til målet RNA og er konjugert til samme fluorescerende farge. Binding av en enkelt fluorescerende sonde gir svakt signal, men signalet fra ensemblet i alle sonder er robust. Denne funksjonen forbedrer signal-til-støy-forhold fordi selv om en enkelt sonde kan vise off-målet bindende, slik signalet forventes å bli veldig svak sammenlignet med målet RNA molekylet3. I feil gjenkjenning, kan antall RNA molekyler telles og forhold i ulike vekst forhold og blant annet mutanter.
Siden sin første utvikling, har smFISH blitt tilpasset for å studere ulike aspekter av gene expression4, som transkripsjon forlengelse1,2, skjøting5,6, transcriptional sprengning7 , 8 , 9, intracellulær allel uttrykk10,11,12og RNA lokalisering13,14,15. Nylig vi har brukt denne metoden for å studere uttrykk for to transkripsjon isoformene på det samme genet, der kort transkripsjon isoformen (NDC80ORF) har hele sekvensen delt med den lange isoformen (NDC80luti )16. Identifiserer de to mRNA isoformene, vi brukte to sonde sett: ett gjelder unike sekvensen av NDC80luti, og andre settet, konjugert til en annen fluorescerende farge, binder til vanlige regionen de to isoformene. NDC80luti RNA identifiseres som en colocalized sted med både fluorescerende signaler, mens den NDC80ORF RNA er en som inneholder bare signalet fra det felles settet som sonde. Siden antallet av NDC80ORF utskrifter beregnes ved en “subtraksjon” metode, høy effektivitet av sonden hybridisering og høy signal-til-støy forholdet er trygt identifisere smFISH flekker og redusere feil overføring.
Dette dokumentet beskriver en optimalisert protokoll for å utføre smFISH i spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. I denne protokollen, de celle nummer, fiksering, fordøyelsen tid, fordøyelsen buffer, sonde konsentrasjon, og hybridisering bufferen for smFISH eksperimentene var optimalisert for SK1 belastning bakgrunnen av S. cerevisiae gjennomgår vegetative vekst eller meiose. Men vi også merke i dette manuskriptet: (1) metode for å sjekke kvaliteten på dataene som smFISH etter bildeopptak, og (2) skritt i protokollen som krever ytterligere optimalisering for ulike belastning bakgrunner og vekst forhold.
Protokollen presenteres her er avledet fra andre publiserte smFISH protokoller2,3,21,22,23, og er spesielt optimalisert for gjær belastning bakgrunnen SK1. Parameterne optimalisert inkludert celle nummer, fiksering varigheten, sentrifugering hastigheten og varighet, fordøyelsen varighet, fordøyelsen buffer, sonde konsentrasjon og hybridisering buffer. Andre parametere som hybridisering temperatur og varigheten var ikke optimalisert. I denne delen dele vi noen notater som kan tilpasse denne protokollen for eventuelle gjær belastning bakgrunn og vekst forholdene rundt.
Cellen vegg av spirende gjær er en stor utfordring mot å oppnå høy kvalitet smFISH bilder i spirende gjær fordi cellen vegg forhindrer sonde penetrasjon. Ufullstendig fordøyelsen av cellen vegg av zymolyase fører til ineffektiv hybridisering sonder og høye celle til celle variasjon i signal. Men kan over fordøyelsen gjøre celler for skjøre, fører til betydelig celle tap under vask trinnene og cellen sprengning under lysbildet forberedelse for bildebehandling. Dermed er optimalisere varigheten av fordøyelsen avgjørende. Vi anbefaler å gjennomføre en pilot smFISH eksperiment ved å fordøye samme utvalget for forskjellige mengder tid. I vårt tilfelle oppnådd vi best smFISH dataene hvis vi stoppet fordøyelsen når ~ 80% av celler ble ikke-refraktiv. Vanligvis for samme vekst betingelsen, kan ulike genetisk muterte stammer bli fordøyd med lignende timing. Varigheten av fordøyelsen er imidlertid sammenlignet blant annet vekst forhold og ulike stadier av meiose i spirende gjær. Når tidspunktet er bestemt, er kvaliteten på smFISH reproduserbare. Merk kan at for mutant stammer med defekt cellevegg syntese og/eller sammensetning, fordøyelsen kan gjennomføres på mindre enn 15 min. Bruk av ulike grupper av zymolyase også litt endre fordøyelsen timing.
Optimal sonde konsentrasjon er nødvendig for å oppnå en høy signal-til-støy-forhold. Vi designet og kjøpt våre smFISH sonder kommersielt. God sonder (ofte 20-mers) bør ha en prosentandel av GC spenner fra 35% til 45%, en avstand på 2 base parene mellom sonder, og lav kryss-reaktivitet minst. Vi brukte en webbasert sonde designer fra produsenten til å generere en liste over sonder, og hvis det var nok sonder å velge mellom, vil vi bruke BLAST algoritmen i Saccharomyces genomet databasen for å eliminere sonder med mer enn 17 base parene overlappet med andre genomisk. Vi valgte mer photostable fluorescerende farge (CAL Fluor 590) for sonden settet som anneals til den unike regionen NDC80luti (CF 590) fordi i dette settet, antall sonder som fornøyd alle de ovennevnte kriteriene (20 sonder) var lavere enn den minimum antall anbefalt av produsenten (~ 25 sonder). Etter gjenoppbygge sonde løsningen etter produsentens instruksjoner, gjorde vi en 1:10 fortynning av lager løsningen og lagret utvannet løsningen i 5-µL dele på-20 grader. Hver aliquot ble brukt bare en gang. For optimalisering, bør man gjøre føljetong fortynninger fra 1:10 utvannet løsning og test som konsentrasjon gir best signal-til-støy-forhold. Vi anbefaler å foreta en fortynning rekke 1:250, 1:500, 1:1000 og 1:2000 fra det opprinnelige lageret. I vårt tilfelle førte en fortynningsfaktoren for 1:500 beste signal-til-støy forholdet, for både CF 590 og Q 670 sonde sett.
Optimal fiksering tid er også avgjørende for vellykket smFISH i spirende gjær. Vi fant at natten fiksering på 4 grader, snarere enn fikse ved romtemperatur for 20 min, forbedret konsistens og kvaliteten på smFISH resultatene for meiotic prøver. Selv om vi ikke har testet hvordan natten fiksering kan påvirke vegetative prøver, fiksering ved romtemperatur fungerte bra for denne veksten tilstanden. Dermed for å optimalisere smFISH protokollen for nye stammer eller betingelser for vekst, anbefaler vi starter med kort fiksering tid ved romtemperatur og øke fiksering tid hvis det høye variasjon av signal.
Sammenlignet med andre publiserte protokoller3,22,23, bruker vår protokollen den RNase inhibitor VRC under fordøyelsen og en høyere konsentrasjon av VRC under hybridisering. Tillegg av VRC i disse to trinnene forbedret konsistensen av smFISH resultatene, muligens med bedre bevare RNA molekyler mot nuclease aktivitet, som kan være innført av zymolyase mix (enzymet er renset fra råolje ekstrakter og kan inneholde RNase forurensninger). Derfor anbefaler vi bruker mengde VRC som er oppført i protokollen eller enda høyere konsentrasjoner av VRC for optimalisering.
En betydelig del av cellene kan gå tapt under vask trinnene i både Buffer B og vaskebuffer formamide. For å redusere tap av cellen, kan en øke sentrifugering hastigheten. I vårt tilfelle vasker med høy hastighet (21000 x g) for å pellets våre prøver under Buffer B reduserte celle tap. Imidlertid blir celler svært skjøre etter zymolyase fordøyelsen, slik endring sentrifugering hastigheten ikke anbefales. I stedet foreslår vi bruke lav-vedheft rørene fra USA vitenskapelig, som hjelper pellets cellene under vasker i formamide vaske bufferen. Samlet kan våre protokollen konsekvent generere en monolayer av celler tett nok for effektiv bildebehandling. Vanligvis 7 synsfelt skal gi > 130 celler egnet for kvantifisering.
Endelig er det viktig å bestemme optimale parametere for og utganger behov fra bildeanalyser. For å finne smFISH steder, publiserte analyse programmer vanligvis filtrere raw-bilder bruke Gaussian kjernen til å fjerne bakgrunn signal, og be brukerne å bestemme signal-til-støy forholdet skal brukes for hvert sett med bilder2,17. Dessverre, det er ikke en enkelt standard som riktige parametere er bestemt, og så noen empirisk testing av disse forskjellige innstillinger er nødvendig. Hvis du vil angi parametere som kreves for hver av disse trinnene, må man iterativt inn ulike sett med parametere og sjekke hvor godt resultatene fra hvert kamper som fra manuell telling i noen representant celler. Når et sett med parametere er funnet, kan den brukes for det meste av bilder innhentet til tross for ulike vekst forhold og genetisk bakgrunn.
I tillegg kan en test Hvis maksimalt intensitet projeksjon av smFISH bildene kan utføres før kvantifisering22. Dette trinnet forenkler den spot algoritmen og reduserer tenkelig tid, men på bekostning av noen potensielt nyttig informasjon om enkeltsteder, som deres subcellular lokalisering. I vårt tilfelle var antall mRNA molekyler produsert av NDC80 genet lav nok til at de ble godt skilt etter denne behandling (ikke uvanlig for utskrifter i spirende gjær3,7). I tilfeller der colocalization analyse er kritisk må analyse rørledningen bestemme plasseringen av hver smFISH spot i hver enkelt kanal å vurdere colocalization. Avhengig av konkrete spørsmål blir spurt, annen informasjon som intensiteten av hver spot må også hentes fra pipeline for videre analyse. Optimalisere nøkkelen trinn i protokollen og rørledningen bildet analyse er avgjørende i å få høy kvalitet for smFISH å studere spørsmålet rundt.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Anne Dodson og Stephanie Heinrich for råd om hvordan å optimalisere smFISH protokollen, Xavier Darzacq for hjelp med analyse plattform, Haiyan Huang forslag på den statistiske analysen. Dette arbeidet ble støttet av midler fra mars Dimes (5-FY15-99), Pew veldedige stiftelser (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) og Glenn Foundation som EÜ og et NSF Graduate forskning Fellowship Grant. DGE-1106400 til JC.
BSA, RNase-free (50 mg/mL) | Ambion | AM2616 | Store at -20 °C. |
Catalase | Sigma | C3515 | Store at 4 °C for short-term. Vortex before use. |
DAPI | Sigma | D9564 | Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light. |
50% Dextran Sulfate | Milli Pore | S4030 | Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience. |
E. coli tRNA | Sigma | R4251 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Ethanol (100%, 200 proof) | various | Flammable. | |
37% Formaldehyde | Fisher | F79-500 | Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution. |
Formamide | Ambion | AM9342 | Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. |
Glucose | various | Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water. | |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5. |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | Store at room temperature. |
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) | various | Store at room temperature. | |
Probe library, diluted in TE, pH 8.0 | Biosearch Technologies | Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. | |
Sorbitol | various | Store at room temperature. | |
20X SSC | Ambion | AM9763 | Store at room temperature. |
TE, pH 8.0 | Ambion | AM9849 | Store at room temperature. |
1 M Tris, pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Store at room temperature. |
Trolox | Sigma | 238813 | Store at -20 °C in aliquots. |
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | NEB | S1402S | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer. |
Zymolyase 100T | MP Biomedicals | 08320932 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Low-adhesion tubes | USA Scientific | 1415-2600 | Store at room temperature. |