यहाँ हम एक कोशिका आधारित प्रवाह cytometry विधि बेअसर एंटीबॉडी या अन्य कारकों का पता लगाने के लिए कि एक मानव मैट्रिक्स में एंजाइम प्रतिस्थापन उपचारों के सेलुलर के साथ हस्तक्षेप, इस तरह के मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी के रूप में (सीएसएफ) या मानव सीरम.
एंजाइम प्रतिस्थापन उपचार (ERTs) और रोगियों के लिए अन्य जीवविज्ञान चिकित्सा के प्रशासन एक विरोधी दवा प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में लाना हो सकता है. इन विरोधी दवा एंटीबॉडी (एडीए) के लक्षण वर्णन, विशेष रूप से उन है कि दवा की जैविक गतिविधि बेअसर हो सकता, एंटीबॉडी (नबस) बेअसर, है दवा पर इन एंटीबॉडी के प्रभाव को समझने में महत्वपूर्ण है औषधीय प्रोफ़ाइल । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक सेल आधारित प्रवाह cytometry विधि कारकों का पता लगाने के लिए कि मानव मैट्रिक्स में एक प्रतिनिधि lysosomal ईआरटी के सेलुलर तेज बेअसर । प्रोटोकॉल तीन प्रक्रियाओं के होते हैं: स्क्रीनिंग, एक पुष्टि कदम है, और titer परख का पता लगाने के लिए, पहचान, और विषय के नमूनों में एंटीबॉडी titer बेअसर के सापेक्ष स्तर की स्थापना ।
इस विधि में, नमूने पहले fluorophore-संयुग्मित ईआरटी उत्पाद के साथ मिश्रित कर रहे हैं, तो कोशिकाओं के साथ मशीन [जैसे, मानव टी लिम्फोसाइटों (Jurkat कोशिकाओं)] है कि एक सेल-सतह कटियन-स्वतंत्र mannose 6 फॉस्फेट रिसेप्टर (CI-M6PR) एक्सप्रेस, और अंत में, एक प्रवाह cytometer के साथ विश्लेषण किया । नबस बिना एक नमूना ci-M6PR के माध्यम से fluorophore-संयुग्मित ईआरटी उत्पाद की अधिकता में परिणाम होगा, जबकि, नबस की उपस्थिति दवा के लिए बाध्य और सीआई-M6PR बाध्यकारी और के साथ हस्तक्षेप करेंगे । fluorophore की राशि-संयुग्मित Jurkat कोशिकाओं द्वारा आंतरिक ईआरटी प्रवाह cytometry द्वारा मापा जाता है और प्रतिशत के रूप में मूल्यांकन (%) संकेत निषेध एक प्रतिनिधि दवा की उपस्थिति में प्राप्त की प्रतिक्रिया की तुलना में-भोली मैट्रिक्स । पुष्टि कदम में, नमूनों पूर्व ईआरटी-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ मशीन को चूस रहे है दवा विशिष्ट कारकों है कि (जैसे नबस के रूप में) कोशिकाओं के साथ एक मशीन से पहले दवा को बांध । नमूनों कि स्क्रीन और दवा की पुष्टि के लिए सकारात्मक परख में विशेष नबस तो धारावाहिक के लिए एक एंटीबॉडी titer उत्पंन पतला कर रहे हैं । अर्द्ध मात्रात्मक एंटीबॉडी titers दवा सुरक्षा और प्रभावकारिता की माप के साथ संबद्ध किया जा सकता है ।
Immunogenicity आकलन ERTs सहित किसी भी जीवविज्ञान चिकित्सकीय उत्पाद के लिए सुरक्षा और प्रभावकारिता निगरानी कार्यक्रम का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है । रोगियों को एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि सीधे दवा सुरक्षा, प्रभावकारिता, और pharmacokinetic/pharmacodynamic प्रोफाइल प्रभाव कर सकते है विकसित हो सकता है । इन एडीए के एक सबसेट, नबस कहा जाता है, दो मायनों में ईआरटी प्रभावकारिता को बाधित कर सकते हैं: ईआरटी के निषेध के माध्यम से लक्षित सेल में या ईआरटी उत्प्रेरक गतिविधि बाधा द्वारा । विधि यहां प्रस्तुत नबस उपाय है कि कोशिकाओं में ईआरटी के साथ हस्तक्षेप करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । पूरी तरह से सुरक्षा और चिकित्सीय ईआरटी की प्रभावकारिता की निगरानी करने के लिए, नबस की सतत निगरानी नैदानिक परिणाम या pharmacodynamic प्रभाव1के साथ किसी भी संभावित सहसंबंध elucidating में महत्वपूर्ण है.
प्रोटीन चिकित्सकीय के खिलाफ नबस के मूल्यांकन के लिए प्लेटफार्मों सेल आधारित, एंजाइमी गतिविधि और ligand-बाध्यकारी परख1शामिल हैं । इष्टतम परख मंच मानदंड की एक किस्म के आधार पर चयनित है: चिकित्सकीय उत्पाद की कार्रवाई की व्यवस्था, परख मंच संवेदनशीलता, selectivity, परिशुद्धता, और महत्वपूर्ण बात, इसकी क्षमता vivo में नबस के निरोधात्मक कार्रवाई की नकल करने के लिए . Ligand-बाध्यकारी परख कुछ मामलों में उपयुक्त हो सकता है (जैसे, जब एक प्रासंगिक सेल लाइन की पहचान नहीं की जा सकती है या यदि उचित संवेदनशीलता एक सेल में प्राप्त नहीं किया जा सकता है आधारित परख) । हालांकि, उद्योग दस्तावेज और अंय उद्योग के लिए २०१६ मसौदा एफडीए मार्गदर्शन में सफेद कागज स्वीकार किए जाते हैं, सेल आधारित पकड़ने की परख की सिफारिश कर रहे है क्योंकि वे बेहतर vivo1,2 में दवा के जैविक तंत्र को प्रतिबिंबित कर सकते है , 3.
एक प्रवाह cytometry कोशिका के विकास के लिए महत्वपूर्ण घटक-नब परख आधारित एक उपयुक्त सेल लाइन है कि दवा उत्तेजना, एक किराए की सकारात्मक नियंत्रण नब कि ईआरटी, एक fluorophore-संयुग्मित ईआरटी बेअसर, और परीक्षण प्रजातियों जैविक का जवाब शामिल मैट्रिक्स4,5,6। कक्ष लाइन चयन कार्रवाई के ईआरटी तंत्र पर निर्भर है और कई सेल लाइनों परख विकास3के दौरान मूल्यांकन किया जाना चाहिए । यहां वर्णित विधि में, मानव Jurkat टी कोशिकाओं उनके अंतर्जात CI-सेल सतह पर M6PR अभिव्यक्ति और एंटीबॉडी टुकड़ा रिसेप्टर्स (FcRs) है कि अंधाधुंध सबसे एंटीबॉडी7,8 के एफसी क्षेत्र बांध के अभाव के लिए चुना गया . परख विकास के दौरान, यह मांयता अध्ययन और रोगी नमूना परीक्षण के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, ऐसे व्यक्तियों है कि परीक्षण के अनुच्छेद1के साथ इलाज नहीं किया गया है से परित के रूप में । सेल लाइनों भी गैर नैदानिक, नैदानिक, और दवा के विकास के बाद विपणन चरणों में निरंतरता के लिए विभिंन प्रजातियों से प्रासंगिक मैट्रिक्स बर्दाश्त1। एक अंय घटक है परख सकारात्मक नियंत्रण का चयन है । ईआरटी सेल के लिए सकारात्मक नियंत्रण परख अपने को चिकित्सीय बांध और CI के माध्यम से ले बेअसर-M6PR9,1की क्षमता के आधार पर चुना गया था । यह अक्सर एक परख नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए मानव विषयों से antisera बेअसर की उपयोगी या टिकाऊ मात्रा प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, विशेष रूप से दुर्लभ रोग रोगी आबादी2में । विकल्प हाइपर प्रतिरक्षित पशुओं, या अपनत्व से antisera शामिल-शुद्ध polyclonal या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी परख प्रासंगिक मैट्रिक्स1में नुकीला । एक प्रजाति-विशिष्ट मैट्रिक्स का उपयोग करते समय, यह संभव है कि मैट्रिक्स में मौजूद एंटीबॉडी के अलावा निरोधात्मक कारकों ईआरटी को बाधित कर सकते हैं । परख के एक अंय महत्वपूर्ण घटक fluorophore-संयुग्मित ईआरटी है । ईआरटी विकार के लिए fluorophore का चयन प्रत्येक ईआरटी के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए, चमक के लिए है परख की जरूरत पर आधारित, पीएच स्थिरता, और संभावित वर्णक्रमीय प्रवाह cytometer पर अंय चैनलों में ओवरलैप ।
परख यहां वर्णित एक ईआरटी के रूप में एक चिकित्सीय प्रोटीन को पकड़ने के लिए एक उदाहरण है, कि CI-M6PR के माध्यम से सेल में प्रवेश करती है । कई ERTs, lysosomal भंडारण विकारों (LSDs) के इलाज के लिए इरादा, सेल के लिए इस मार्ग का उपयोग और lysosomal लक्ष्यीकरण, elosulfase के लिए Morquio अल्फा सहित एक सिंड्रोम, cerliponase CLN2 रोग, बैटन के लिए agalsidase अल्फा Fabry रोग के लिए, और धूमधाम से रोग के लिए alglucosidase अल्फा10,11. इस पद्धति का उद्देश्य नबस के सापेक्ष स्तर को मापने के लिए है कि CI-M6PR के माध्यम से दवा बाध्यकारी और internalization के साथ हस्तक्षेप । यह tiered स्क्रीनिंग, पुष्टि, और titer चरण3में किया जाता है । नमूने पहले धनात्मकता को पकड़ने के लिए दिखलाई पड़ते हैं और फिर पुष्टि चरण में सकारात्मक की पुष्टि करते हैं. अंत में, नमूने है कि स्क्रीन और सकारात्मक पुष्टि करने के लिए एक एंटीबॉडी titer1उत्पंन करने के लिए पतला हो सकता है । इस कोशिका आधारित प्रवाह cytometry दवा को तेज परख प्रदान करता है एक संवेदनशील और mechanistically में प्रासंगिक इन इन विट्रो विधि दवा की विशिष्ट नबस है कि एक दवा औषधीय प्रोफ़ाइल को प्रभावित कर सकते हैं को मापने के । हम पहले विधि की पुष्टि की और दवा elosulfase अल्फा8के लिए इस मंच का उपयोग नैदानिक नमूनों का परीक्षण किया. यहां हम विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल है कि अंय चिकित्सीय प्रोटीन या ERTs के लिए लागू किया जा सकता है का वर्णन ।
एंटीबॉडी या अन्य कारकों है कि CI-M6PR के माध्यम से ईआरटी को रोकने को निष्क्रिय ईआरटी सुरक्षा या प्रभावकारिता1प्रभाव की क्षमता है. इसलिए, यह एक मजबूत कार्रवाई की दवा तंत्र के लिए प्रासंगिक मॉडल का उपयोग कर विषय नमूनों में नबस का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम और दूसरों ने पाया है कि कुछ परख प्रारूपों के प्रदर्शन (जैसे, रिसेप्टर dimerization, luciferase अभिव्यक्ति, आदि) परख परिशुद्धता, reproducibility के लिए स्वास्थ्य प्राधिकरण सिफारिशों के साथ संरेखित नहीं है, और संवेदनशीलता 29. परख विधि में यहां वर्णित है, Jurkat कोशिकाओं है कि अंतर्जात CI-M6PR एक्सप्रेस को नबस lysosomal ईआरटी के लिए विशिष्ट निगरानी कार्यरत हैं । एक प्रवाह cytometry readout के साथ संयुक्त, इस परख उपयुक्त परख परिशुद्धता, संवेदनशीलता, reproducibility, और उच्च नमूना प्रवाह के साथ एक शारीरिक सेल मॉडल का उपयोग करता है । एक प्रवाह के साथ नब पता लगाने cytometry readout भी अन्य संकेतों के लिए लागू किया गया है. उदाहरण के लिए, हेपेटाइटिस ई और adeno से जुड़े वायरस (AAV)30,31के खिलाफ पूर्व मौजूदा एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए तरीके विकसित किए गए हैं ।
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम एक उपयुक्त fluorophore चयन शामिल है, एक LQC है कि परख संवेदनशीलता पर नज़र रखता है शामिल है, सेल व्यवहार्यता के एक पर्याप्त स्तर को सुनिश्चित करने, और गर्मी के समय के लिए सख्त पालन बनाए रखने । यहां प्रस्तुत उदाहरण में, fluorophores (जैसे, alexa Fluor ४८८, alexa Fluor ६४७, और CypHer 5e), एक संयुग्मित lysosomal को ईआरटी, व्यापक रूप से उनके प्रदर्शन में विविध । Alexa Fluor ६४७, जो भी प्रतिभाशाली fluorophore३२परीक्षण किया गया था, आगे परख विकास के लिए चुना गया था । हम अनुशंसा करते हैं कि कई fluorophores पर जल्दी मूल्यांकन किया जा परख के विकास में सबसे अच्छा संवेदनशीलता और गतिशील रेंज प्रदान करने के लिए. नमूना परीक्षण के दौरान परख संवेदनशीलता एक LQC कि संवेदनशीलता सीमा के लिए पर्याप्त है कि यह परीक्षण के 1% में विफल हो जाएगा सहित द्वारा निगरानी की जानी चाहिए1रन । HQC के साथ साथ, LQC भी एक प्रणाली उपयुक्तता QC के रूप में कार्य करता है के लिए समय3पर परख बहाव की निगरानी । इष्टतम सेल व्यवहार्यता और प्रदर्शन एकल उपयोग aliquots के एक सेल बैंक तैयार करने और नए सेल बैंकों में तुलनीय QC परिणाम3,18के आधार पर अर्हता प्राप्त की है । सेल और fluorophore-संयुग्मित दवा मशीन बार भी एक लगातार परख प्रदर्शन के लिए केंद्रीय समय दवा कोशिकाओं के साथ मशीन है की मात्रा के साथ बढ़ जाती है के बाद से कर रहे हैं । दवा के साथ-साथ दिन में दिन में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, नमूना डेटा प्रत्येक प्लेट पर परित मैट्रिक्स नियंत्रण नमूने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है (जैसे, ऊपर विधि में कटौती बिंदु नियंत्रण नमूने). इस विधि के साथ सुसंगत डेटा के उत्पादन में एक और महत्वपूर्ण कारक प्लेट एकरूपता की निगरानी और संभव बढ़त प्रभाव को कम करने के लिए है । एक प्रारंभिक प्रयोग परख पूरी थाली में एक एकल QC का उपयोग कर प्रदर्शन शामिल हो सकते हैं, जबकि अधिक मजबूत प्रयोगों परख सत्यापन के दौरान प्रदर्शन किया जा सकता है (जैसे, परिशुद्धता और सटीकता)1। यह थाली नक्शा लेआउट३३के महत्व को दर्शाता है । प्लेट मानचित्र उदाहरण में दिखाया गया है, गुणवत्ता नियंत्रण प्लेट के दोनों किनारों पर रखा नमूने एक एकरूपता है कि Levey-Jennings चार्ट३४के साथ समय पर नज़र रखी जा सकती है ।
हालांकि इस परख नबस और अंय कारकों है कि lysosomal ईआरटी को बाधित कर सकते है पर नज़र रखता है, अतिरिक्त प्रयोगों के लिए एक ले एंटीबॉडी के कारण संकोच की पुष्टि आयोजित किया जा सकता है । एक विकल्प के लिए प्रोटीन के साथ नमूनों का इलाज है A/G/L, जो गैर-विशेष रूप से immunoglobulin३५बांधता है । यदि नमूने के बाद सकारात्मक परीक्षण के लिए जारी रखें प्रोटीन a/G/L कमी, एक गैर-एंटीबॉडी निरोधात्मक कारक दवा को रोकने के लिए जिम्मेदार हो सकता है. विधि यहां वर्णित एंटीबॉडी-मध्यस्थता तेज निषेध को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया था, और सकारात्मक नियंत्रण और अन्य परख पैरामीटर यदि गैर-एंटीबॉडी निरोधात्मक कारकों के साथ विषय नमूनों की एक उच्च प्रतिशत पाया जाता है पर पुनर्विचार किया जाना चाहिए.
परख भी आगे fluorophore का प्रदर्शन करने के लिए विशेषता हो सकती है-कार्रवाई की दवा तंत्र के आधार पर उचित सेलुलर डिब्बे के लिए दवा यातायात लेबल । यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में, एक ईआरटी को सीआई-M6PR को कोशिका की सतह पर बाँधने की आशा है और यह lysosome को यातायात. हम पहले से संकेत है कि लगभग फ्लोरोसेंट संकेत के सभी fluorophore से विधि परिणामों में मनाया-lysosome8में ईआरटी लेबल कई प्रयोगों के परिणामों की सूचना दी । हमने पाया है कि fluorophore-ईआरटी संकेत लेबल cytochalasin बी, जो actin पुनर्गठन के निषेध के माध्यम से internalization बाधित के साथ कोशिकाओं के उपचार के बाद समाप्त किया गया था । इसके अलावा, प्रयोग है कि trypan नीले रंग के साथ बाहरी fluorophore बुझती है, या 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखकर internalization धीमा, संकेत मिलता है कि fluorophore-लेबल ईआरटी तेजी से आंतरिक है और बहुत कम प्रतिदीप्ति एक ईआरटी के कारण है सेल सतह पर बंधे । Lysosomal लक्ष्यीकरण की पुष्टि की सह-स्थानीयकरण के साथ पीएच के संवेदनशील lysotracker डाई fluorophore-संयुग्मित दवा का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ. CI-M6PR के माध्यम से ऊपर उठाने के लिए एक विशिष्टता भी रिसेप्टर बाइंडिंग के लिए लेबल दवाओं के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए exogenous M6P का उपयोग कर सत्यापित किया जा सकता है. इसी तरह के प्रयोगों को अन्य परख में fluorophore-संयुग्मित दवाओं के कैनेटीक्स और सेलुलर स्थानीयकरण की पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए ।
इस सेल-परख मंच आधारित चिकित्सीय दवाओं है कि CI-M6PR रिसेप्टर endocytosis मध्यस्थता का उपयोग करने के लिए नबस अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हम हाल ही में इस परख मंच है कि elosulfase अल्फा३६,३७के लिए एक पकड़ने और दवा प्रभावकारिता के विकास के बीच कोई संबंध का प्रदर्शन का उपयोग कर परिणाम की सूचना दी । नैदानिक नमूना परीक्षण के लिए परख मांय करने के लिए, पैरामीटर, परख संवेदनशीलता सहित, परिशुद्धता, selectivity, विशिष्टता, दवा सहिष्णुता, मजबूती, और कटौती अंक, स्थापित मार्गदर्शन3 के अनुसार मूल्यांकन किया जाना चाहिए, 4. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए, lysosomal ERTs के लिए, कि नबस एंजाइम उत्प्रेरक साइट के पास बाध्यकारी के माध्यम से दवा गतिविधि के साथ हस्तक्षेप करने की क्षमता के साथ विकसित कर सकते हैं । सामांय में, हम lysosome के कठोर अंलीय और proteolytic पर्यावरण के बाद से एक कम प्राथमिकता का होना करने के लिए इस प्रकार की निगरानी पर विचार एंटीबॉडी-ईआरटी2,३९,४०बातचीत करने के लिए अनुकूल नहीं है । हालांकि, यह संभव है कि proteolytic प्रतिरोधी नबस मौजूद है और एक दवा४०के उत्प्रेरक भाग को बाधित कर सकते हैं । इस परख fluorophore पर नज़र रखता है-ईआरटी lysosome को ले लेबल, और परख की सीमा proteolytic-प्रतिरोधी नबस की निगरानी करने में असमर्थता है । यदि इस प्रकार की नब सुरक्षा या प्रभावकारिता डेटा पर आधारित संदिग्ध है, एक परख है कि ईआरटी गतिविधि पर नज़र रखता है विकसित किया जाना चाहिए और नमूनों का परीक्षण किया ।
immunogenicity का आकलन औषध सुरक्षा और प्रभावकारिता पर नबस के प्रभाव को समझने में महत्वपूर्ण है. नबस की पहचान इन विट्रो दवा पर बाधा के माध्यम से CI-M6PR में सक्षम करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है vivo मेंपकड़ने गतिविधि को समझने के लिए । विधि यहां प्रस्तुत एक मानव कोशिका रेखा है कि CI-M6PR व्यक्त fluorophore-संयुग्मित lysosomal ईआरटी सेलुलर के हस्तक्षेप को मापने के लिए उपयोग करता है । इस विधि पहले से ही कई lysosomal भंडारण रोगों के इलाज के लिए इरादा ERTs के लिए नबस निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस परख मंच जीवविज्ञान चिकित्सकीय कि उनके उचित समारोह के लिए एक सेलुलर internalization की आवश्यकता पर नबस के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अंय तरीकों पर लागू हो सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों की कोई पावती नहीं है.
0.22 µm filter unit, 500 mL vacuum filter flasks | Corning | CLS430769 | |
Round Bottom 96-well culture plates | Thermo-Nunclon | 163320 | |
Sterile reagent reservoirs | VistaLab | 3054-1004 | |
96 well white round bottom polystyrene microplate plate | Corning | 3605 | |
96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips | Corning | 4408 | |
Magnetic bead separator tube rack | V&P Scientific, Inc | VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3 | |
DynaMag -2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
DynaMag -96 Side Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | |
BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
BD High Throughput Sampler (HTS) | BD Biosciences | ||
BioRad TC20 Automated Cell Counter | BioRad | 1450103 | |
Microplate Shaker | VWR | 12620-928 | |
Galaxy MiniStar Microcentrifuge | VWR | C1413 | |
tissue culture CO2 incubator | Nuaire | NU-4750 | |
Biosafety cabinet | Labcono | Purifier Cell Logic + | |
Jurkat Cell Line | ATCC | TIB152™ | |
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | A20173 | |
Dynabeads M270 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 65306 | |
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
RPMI-1640 1X Medium | Life Technologies | A10491-01-500mL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
Pen-Strep (100X) liquid formulation | Corning | 30-002-CI | |
1X DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
4% Para-formaldehyde | Electron Microscopy Science | 15735-85 | |
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Life Technologies | L34955 | |
Tween 20 | Sigma | P1379-100mL | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | 3059 | |
Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid) | Bioreclamation IVT | request a quote from website | |
VWR Polyester Plate Film | VWR | 60941 | |
Seal & Sample Aluminum Foil | Beckman Coulter | 538619 |