Här presenterar vi en cellbaserade flöde flödescytometri metod för att detektera neutraliserande antikroppar eller andra faktorer som stör det cellernas upptaget av enzymet ersätter behandlingar i en mänsklig matris, såsom cerebral spinalvätskan (CSF) eller humant serum.
Administrering av enzymet ersättare terapier (ERTs) och andra biologiska behandlingar till patienter kan framkalla ett anti-drog immunsvar. Karakterisering av dessa anti-läkemedelsantikroppar (ADA), särskilt de som kan neutralisera den biologiska aktiviteten av läkemedlet, kallas neutraliserande antikroppar (NAbs), är avgörande för att förstå effekterna av dessa antikroppar på läkemedlets farmakologiska profilen. Det här protokollet beskriver en cellbaserade flöde flödescytometri metod för att upptäcka faktorer som neutraliserar cellulära upptaget av en representant lysosomala ERT i mänskliga matris. Protokollet består av tre processer: screening, ett bekräftande steg, titer analyser att upptäcka, identifiera och fastställa den relativa neutraliserande antikropp titer i ämnet prover.
Den här metoden prover först blandas med fluorophore-konjugerad ERT produkten sedan inkuberas med celler [e.g., humana T-lymfocyter (Jurkat celler)] som uttrycker en cellytan ering-oberoende mannos-6-fosfat receptor (CI-M6PR), och Slutligen analyseras med en flödescytometer. Ett prov utan NAbs resulterar i upptaget av den fluorophore-konjugerad ERT produkt via CI-M6PR, förekomsten av NAbs kommer att binda till drogen och störa de CI-M6PR bindande och upptag. Mängden av fluorophore-konjugerad ERT internaliseras av Jurkat celler mäts av flödescytometri och utvärderas som andel (%) signal hämning jämfört med de svar som erhållits i närvaro av en representant drog-naiva matris. I steget bekräftande är proven pre ruvade med ERT-konjugerad magnetiska pärlor att tömma drogspecifika faktorer som binder till drogen (såsom NAbs) före en inkubation med celler. Prover som skärmen och bekräfta positiva för drogspecifika NAbs i analysen är sedan seriellt spädas för att generera en titer. Semikvantitativ antikropp titrar kan vara korrelerade med mätningar av drogen säkerhet och effekt.
Immunogenicitet bedömning är en viktig del av säkerheten och effekten övervakningsprogram för alla biologiska terapeutiska produkter, inklusive ERTs. Patienter kan utveckla ett immunsvar som kan direkt påverka drog säkerhet, effekt och farmakokinetiska/farmakodynamiska profiler. En delmängd av dessa ADA, kallas NAbs, kan hämma ERT effekt på två sätt: genom hämning av ERT upptaget in i riktade cellen eller genom att hämma den ERT katalytiska aktiviteten. Metoden presenteras här är utformat för att mäta NAbs som störa ERT upptaget in i celler. För att fullt ut följa säkerhet och effekt av den terapeutiska ERT, är kontinuerlig övervakning av NAbs avgörande att belysa eventuella potentiella korrelationer med kliniska resultat eller farmakodynamiska effekter1.
Plattformar för att utvärdera NAbs mot protein therapeutics omfattar cellbaserade, enzymatisk aktivitet och ligand-bindande analyser1. Den optimala assay plattformen väljs utifrån olika kriterier: verkningsmekanismen av produktens terapeutiska, assay plattform känslighet, selektivitet, precision och ännu viktigare, dess förmåga att härma den hämmande effekten av Joula i vivo . Ligand-bindande analyser kan vara lämpligt i vissa fall (t.ex.när en relevant cellinje inte kan identifieras eller om lämplig känslighet inte kan uppnås i en cell-baserad analys). Dock i 2016 utkastet till FDA riktlinjer för branschen dokument och andra branschen godtagna vitböcker, cellbaserade NAb analyser rekommenderas, eftersom de får bättre återspegla den biologiska mekanismen av drogen i vivo1,2 , 3.
De kritiska komponenterna för att utveckla en flöde flödescytometri cellbaserade NAb analysen inkludera en lämplig cellinje som svarar på läkemedlet stimulering, en surrogat positiva-kontroll NAb som neutraliserar ERT, en fluorophore-konjugerad ERT och den biologiska art Matrix4,5,6. Cell linjeval är beroende av ERT verkningsmekanismen och flera cellinjer bör utvärderas under den assay utveckling3. I den metod som beskrivs här, valdes mänskliga Jurkat T celler för deras endogena CI-M6PR uttryck på cellytan och avsaknaden av antikropp fragment receptorer (FcRs) som urskillningslöst binder regionen Fc i de flesta antikroppar7,8 . Under analysen utvecklingen är det viktigt att etablera en negativ kontroll för valideringsstudier och patientprovet testning, såsom serum som poolats från individer som inte har behandlats med den test artikel1. Cellinjer bör också tolerera relevanta matriser från olika arter för kontinuitet investeringsfaser de prekliniska, kliniska och efter godkännande för försäljning av läkemedlet utveckling1. En annan komponent är urvalet av analysens positiv kontroll. Den positiva kontrollen för ERT cell upptag analysen valdes utifrån dess förmåga att binda den terapeutiska och neutralisera upptaget genom CI-M6PR9,1. Det är ofta svårt att få användbar eller hållbar mängder neutraliserande antiserum från försökspersoner för användning som en assay kontroll, speciellt i sällsynt sjukdom patientpopulationer2. Alternativ inkluderar antiserum från hyper-vaccinerade djur eller affinitet-renat till spetsade in i assay relevanta matris1polyklonala eller monoklonala antikroppar. När du använder en artspecifik matris, är det möjligt att hämmande faktorer än antikroppar som är närvarande i matrisen kan hämma ERT upptaget. En annan viktig komponent i analysen är den fluorophore-konjugerad ERT. Valet av fluorophore för ERT konjugationen bör utvärderas för varje ERT, baserat på analysens behovet av ljusstyrka, pH stabilitet och potentiella spektrala överlappning i andra kanaler på flödescytometer.
Den analysmetod som beskrivs här är ett exempel för att mäta en NAb till en terapeutisk protein, såsom en ERT, som går in i cellen via CI-M6PR. Flera ERTs, avsedd att behandla lysosomala lagring sjukdomar (LSDs), utnyttja denna väg för cell upptag och lysosomala inriktning, inklusive elosulfase alfa för Morquio A syndrom, cerliponase alfa för CLN2 Batten disease, agalsidasalfa för Fabrys sjukdom, och alglukosidas alfa för Pompes sjukdom10,11. Syftet med denna metod är att mäta de relativa NAbs som störa drog bindande och internalisering via CI-M6PR. Detta utförs i skiktad screening, bekräftande och antikroppnivåns steg3. Proverna först screenas för NAb positivitet och sedan bekräftade positiva i bekräftande steg. Slutligen, prover som skärmen och bekräfta positiva seriellt spädas för att generera en antikropp titer1. Denna cell-baserad flöde flödescytometri drog upptag analys ger en känslig och slentrianmässigt relevanta in vitro- Metod för att mäta drogspecifika NAbs som kan påverka en läkemedlets farmakologiska profil. Vi har tidigare validerade metoden och testade kliniska prover med hjälp av denna plattform för drogen elosulfase alfa8. Här beskriver vi de detaljerade stegvisa protokoll som kan tillämpas på andra terapeutiska proteiner eller ERTs.
Neutraliserande antikroppar eller andra faktorer som hindrar ERT upptaget genom CI-M6PR har potential att påverka ERT säkerhet eller effekt1. Det är därför viktigt att utvärdera NAbs i ämnet prover med en robust modell som är relevanta för läkemedlets verkningsmekanism. Vi och andra har hittat att inte justeras prestanda för vissa bioassay format (t.ex., receptor dimerization, luciferas uttryck, etc.) med hälsa myndigheten rekommendationer för Analysens precision, reproducerbarhet och känslighet 29. i bioassayen metoden som beskrivs här Jurkat celler som uttrycker endogena CI-M6PR är anställda att övervaka NAbs specifika för lysosomala ERT upptaget. Denna analys i kombination med en flöde flödescytometri avläsning, och använder en fysiologisk cell modell med precision lämplig analys, känslighet, reproducerbarhet och hög provkapacitet. NAb upptäckt med ett flöde flödescytometri avläsning har också tillämpats på andra indikationer. Exempelvis har metoder utvecklats för att upptäcka befintliga antikroppar mot hepatit E och adeno-associerade virus (AAV)30,31.
Kritiska steg i protokollet är att välja en lämplig fluorophore, införliva en LQC att bildskärmar assay känslighet, att säkerställa en tillräcklig nivå av cellernas viabilitet, och upprätthålla strikt följsamhet till inkubationstider. I de exempel som presenteras här, fluorophores (t.ex., Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 och CypHer 5e), konjugerat till en lysosomala ERT, varierat mycket i sina prestationer. Alexa Fluor 647, som också var den ljusaste fluorophore testade32, valdes ut för vidare analys utveckling. Vi rekommenderar att flera fluorophores utvärderas tidigt i utvecklingen av analysen att ge den bästa känslighet och dynamiskt omfång. Analysens känslighet under provtagning bör övervakas av inklusive en LQC som är tillräckligt nära till känslighet gränsen att det kommer att misslyckas i 1% av tester körs1. Tillsammans med HQC fungerar LQC också som ett system lämplighet QC övervaka assay drift över tid3. Optimal cellernas viabilitet och prestanda uppnås genom att förbereda en cell bank engångsbruk alikvoter och kvalificerade i nya cellbanker baserat på jämförbara QC resultat3,18. Cellen och fluorophore-konjugerad drog inkubationstider är också central för en konsekvent assay prestanda eftersom drogen upptag ökar med mängden tid drogen inkuberas med celler. För att minimera variation i drogen upptag, kan exempeldata normaliseras mot poolade matrix kontrollprover på varje tallrik (t.ex., övergångspunkten kontroll proverna i metoden ovan). En annan viktig faktor i att producera konsekventa data med den här metoden är att övervaka plattan enhetlighet och minimera möjliga kanteffekter. Ett första experiment kan omfatta utför analysen använder en enda QC över hela plattan, medan mer robust experiment kan utföras under analysens giltighet (t.ex., precision och noggrannhet)1. Detta visar vikten av de platta karta layout33. Som visas i exemplet plattan karta, placeras kvalitetskontroll prover på båda sidor av den platta bildskärmen en enhetlighet som kan spåras över tid med Levey-Jennings diagram34.
Medan denna analys övervakar NAbs och andra faktorer som kan hämma lysosomala ERT upptag, kan ytterligare försök utföras för att bekräfta en upptag hämning på grund av antikroppar. Ett alternativ är att behandla prover med protein A/G/L, som icke-specifikt binder immunoglobulin35. Om prover fortsätter att testa positivt efter protein A/G/L utarmning, kan en icke-antikropp hämmande faktor vara ansvariga för att blockera drog upptaget. Den metod som beskrivs här var utformat för att mäta antikroppsmedierad upptag hämning, och den positiva kontrollen och andra assay parametrar bör omprövas om en hög andel av ämnet prover med icke-antikropp hämmande faktorer som finns.
Analysen kan också ytterligare kännetecknas för att demonstrera fluorophore-märkt läkemedel trafikerar till den lämpliga mobilfack baserat på läkemedlets verkningsmekanism. I exemplet presenteras här förväntas en ERT binda CI-M6PR på cellytan och trafiken det till Lysosomen. Tidigare rapporterade vi resultaten av flera experiment som visar att nästan alla av fluorescerande signalen observerats i metoden resultaten från fluorophore-märkt ERT i lysosomen8. Vi hittade att signalen fluorophore-märkt ERT eliminerades efter en behandling av cellerna med cytochalasin B, som stör internalisering genom hämning av aktin omorganisation. Även indikerar experiment som härdas externa fluorophore med trypan blå eller långsammare internalisering genom att placera celler vid 4 ° C, att den fluorophore-märkt ERT är snabbt internaliserat och mycket lite fluorescens beror på en ERT bundna på cellytan. Lysosomala inriktning bekräftades genom att visualisera samtidig localizationen av pH-känsliga lysotracker dye med fluorophore-konjugerad drogen med konfokalmikroskopi. En specificitet för upptag genom CI-M6PR kan också kontrolleras med hjälp av exogena M6P för att konkurrera med märkta läkemedel för receptorbindning. Liknande experiment bör utföras för att verifiera upptag kinetik och cellulär lokalisering av fluorophore-konjugerat läkemedel i andra analyser.
Denna cell-baserat test plattform har använts för att studera NAbs för terapeutiska läkemedel som använder CI-M6PR receptormedierad endocytos. Vi rapporterade nyligen resultat med hjälp av denna analys-plattform som visat något samband mellan utvecklingen av en NAb och drogen effekt för elosulfase alfa36,37. För att validera analysen för kliniska prov testning, parametrar, inklusive analysens känslighet, precision, selektivitet, specificitet, drog tolerans, robusthet, och skär punkter, bör utvärderas enligt etablerade guidances3, 4. det bör också noteras, för lysosomala ERTs, att NAbs kan utveckla med potential att störa drog aktivitet genom bindande nära enzym katalytisk platsen. I allmänhet, anser vi att övervaka denna typ av NAb vara av lägre prioritet eftersom den hårda sura och proteolytiska miljön i lysosomen inte är gynnsamt för antikropp-ERT interaktioner2,39,40. Det är dock möjligt att proteolytiska-resistenta NAbs existerar och kan hämma den katalytiska delen av en drog40. Denna assay bildskärmar fluorophore-märkt ERT upptag till lysosomen, och en begränsning av analysen är oförmågan att övervaka proteolytiska-resistenta NAbs. Om denna typ av NAb misstänks baserat på säkerhets- och effektdata, bör en analysmetod som övervakar ERT aktivitet utvecklas och används för att testa prover.
Bedömningen av immunogenicitet är viktigt för att förstå effekterna av NAbs på drog säkerhet och effekt. Identifiering av NAbs kan hämma i vitro drog upptag via CI-M6PR ger en möjlighet för att förstå NAb aktivitet in vivo. Metoden presenteras här utnyttjar en human cellinje som uttrycker CI-M6PR för att mäta störningar av fluorophore-konjugerad lysosomala ERT cellernas upptag. Denna metod har redan använts att övervaka NAbs för flera ERTs avsedd att behandla lysosomala lagring sjukdomar. Denna assay plattform kan gälla andra metoder för att studera effekterna av NAbs på biologiska läkemedel som kräver en cellulär internalisering för sin avsedda funktion.
The authors have nothing to disclose.
Författarna har inga bekräftelser.
0.22 µm filter unit, 500 mL vacuum filter flasks | Corning | CLS430769 | |
Round Bottom 96-well culture plates | Thermo-Nunclon | 163320 | |
Sterile reagent reservoirs | VistaLab | 3054-1004 | |
96 well white round bottom polystyrene microplate plate | Corning | 3605 | |
96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips | Corning | 4408 | |
Magnetic bead separator tube rack | V&P Scientific, Inc | VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3 | |
DynaMag -2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
DynaMag -96 Side Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | |
BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
BD High Throughput Sampler (HTS) | BD Biosciences | ||
BioRad TC20 Automated Cell Counter | BioRad | 1450103 | |
Microplate Shaker | VWR | 12620-928 | |
Galaxy MiniStar Microcentrifuge | VWR | C1413 | |
tissue culture CO2 incubator | Nuaire | NU-4750 | |
Biosafety cabinet | Labcono | Purifier Cell Logic + | |
Jurkat Cell Line | ATCC | TIB152™ | |
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | A20173 | |
Dynabeads M270 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 65306 | |
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
RPMI-1640 1X Medium | Life Technologies | A10491-01-500mL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
Pen-Strep (100X) liquid formulation | Corning | 30-002-CI | |
1X DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
4% Para-formaldehyde | Electron Microscopy Science | 15735-85 | |
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Life Technologies | L34955 | |
Tween 20 | Sigma | P1379-100mL | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | 3059 | |
Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid) | Bioreclamation IVT | request a quote from website | |
VWR Polyester Plate Film | VWR | 60941 | |
Seal & Sample Aluminum Foil | Beckman Coulter | 538619 |