Målet med denne artikkel er å gi en detaljert beskrivelse av anbefalte fremgangsmåtene å vurdere lungefunksjon i bevisst mus ved dobbel-kammer plethysmography.
Air endres opprettet av et bevisst emne puste spontant i en boks for kroppen er grunnlaget for plethysmography, en teknikk som brukes til ikke-invasively vurdere noen funksjoner i lungefunksjon hos mennesker så vel som i forsøksdyr. Denne artikkel fokuserer på bruk av dobbel-kammer plethysmography (DCP) i liten dyrene. Den gir bakgrunnsinformasjon om metodikken samt en detaljert fremgangsmåte for vellykket vurdere lungefunksjon i bevisst, spontant puste dyr på en ikke-invasiv måte. DCP kan brukes til å overvåke lungefunksjon flere dyr i parallell, så vel som å identifisere endringer av aerosolized stoffer over en valgt tidsperiode og gjentatt. Eksperimenter med kontroll og allergiske mus brukes her å demonstrere nytten av teknikken, forklare tilknyttede utfallet parametrene, samt for å diskutere relaterte fordeler og svakheter. Samlet inneholder DCP gyldige og teoretisk lyd readouts som kan klareres evaluere lungefunksjon bevisst liten dyr både ved baseline og etter utfordringer med aerosolized stoffer.
Den økende bruken av små dyr å modell menneskelige luftveissykdommer har oppfordret utviklingen av teknikker for å vurdere kvantitativt funksjonene i luftveiene i disse dyrene. Foreløpig er tvunget oscillation teknikken (FOT) anerkjent som den mest nøyaktige måten å vurdere åndedretts mekanikken i små dyr1,2. Men som nevnt av phenotyping usikkerhet prinsippet, er hva som er oppnådd i måling presisjon med FOT handlet av mot tap i noninvasiveness3. Faktisk er FOT målinger ervervet under kontrollerte eksperimentelle forhold som nødvendiggjør anestesi, trakeotomi eller muntlig intubasjon, samt mekanisk ventilasjon; et scenario langt fra virkeligheten.
I situasjoner hvor kravene eksperimentell proscribe bruk av bedøvende agenter eller ring for liten eller ingen avvik fra dyrets naturlige fysiologiske tilstand, kan dobbel-kammer plethysmography (DCP) vurderes. Som navnet indikerer, består DCP oppsett av to tilkoblede stive kamre bygget for å isolere som hermetisk som mulig at dyret (eller nese), i det fremre kammeret, fra dens syn, i bakre kammer. Stilling, dyret er bevisst og puster spontant mens tilværelse behersket. Fordi veggene i kamrene ikke kan utvide eller trekke, genererer bevegelsen av luft og ut av dyret en tilsvarende, men motsatt bølgeform inne det bakre kammeret, som et resultat av komprimering/dekomprimering av omkringliggende luften. Bølgeform på grunn av nese flyt i fremre kammer og en knyttet til thorax bevegelse i bakre kammer kan dermed atskilt og fanget samtidig. Avhengig av utformingen av DCP, kan disse bølgeformer erverves med en trykket transdusere eller pneumotachographs henholdsvis registrere endringene i kammer trykk eller luftstrøm og ut av kamrene som en funksjon av tid. Sistnevnte tilnærmingen er mer vanlig i dag.
Mens dyr puste frekvens kan nøyaktig bestemmes av noen slags plethysmography teknikker, er situasjonen ikke det samme for fastsettelse av Tidalvolum og relaterte ventilasjon parametrene (f.eks, minuttventilasjon, ekspirasjonsvolum, etc.). I motsetning til hele kroppen plethysmograph (WBP) teknikken, hvor dyr Tidalvolum anslås fra boksen signal4,5, gir DCP teknikken nøyaktig vurderinger av Tidalvolum. Dette er knyttet til direkte oppkjøp av dyrets thorax bevegelse i det bakre kammeret, som er proporsjonal med endringene i lunge volum under puste.
I tillegg til disse nøyaktig ventilatory parametere (f.eksTidalvolum, puste frekvens og minuttventilasjon), noen forstyrrelser i form av respiratoriske syklusen kan også brukes til å undersøke neuronal aspekter som styrer den åndedretts stasjonen eller åndedretts reflekser. Et konkret eksempel på programmet ville være evalueringen av irritasjon potensialet av inhalert stoffer på øvre luftveier sensoriske neurons6. Her, bestemmes varigheten av en pause ved utbruddet av utløpsdato ved å bruke en parameter som heter slutten-Inspiratorisk pause (EIP), også referert til som varighet oppbremsing6. Forlengelse av denne pausen av en irriterende stoffet er forbundet med nedleggelsen av dyr glottis, forårsaker en målbar periode oppbremsing i første del av utløpsdato6,7.
En annen viktig fordel av DCP er at det gir to validert og ubestridte parametere som luftveisobstruksjon. En kalles flyten i midt-tidevanns ekspirasjonsvolum og er forkortet EF508,9,10. Det er luftstrømmen på midtveis volum av hver tidevanns under utløp. EF50 er Hentet fra thorax flyt spor, og kan dermed måles uten fremre kammer (dvs.i hodet ut konfigurasjon). Den andre kalles bestemt airway motstand og er forkortet sRaw11,12,13. Fastsetting av sRaw krever samtidig opptak av dyrets nese og thoracic flyter som det er beregnet fra tidsforsinkelsen mellom disse separate åndedretts spor på null flyt på slutten av inspirasjon. Begrunnelsen som beskriver grunnlaget som denne forsinkelsen gjelder sRaw var expatiated tidligere11. Enkelt sagt, foran endringene i lunge volum luften bevegelsen siden en trykkgradient må utvikle for å kjøre luftstrøm. I en sunn dyr puster stille, er denne forsinkelsen vanligvis svært liten. Imidlertid er trykkgradient som kreves til en gitt flyt (f.eks, en strøm nok til å gi tilstrekkelig ventilasjon) påvirket av graden av luftveiene motstand. Under bronchoconstriction, for eksempel er gradient av trykk er nødvendig for en gitt flyt større, noe som innebærer at dyret må jobbe hardere for å puste. En større gradient trykket i dyrets syn innebærer også at en større del av flyten og ut av den bakre kammeret skyldes dekompresjon/kompresjon av luft i thorax, som er del av den totale thorax utvidelse/retraksjonen som er ut av fase med nasal flyten. Økt motstand på grunn av bronchoconstriction vil dermed øke forsinkelsen mellom bak og foran chambers og øker dermed sRaw. Graderingen press som driver luftstrøm og ut av lungene er også påvirket av første thorax gassvolumet (TGV). På en større TGV for eksempel utvidelse/tilbakekallingen av thorax måtte generere gitt gradering press er større (bare fordi volumet forskyvning som kreves for å generere en gitt gradering press er større), som innebærer også at den dyr må jobbe hardere for å puste. Igjen, disse ekstra thorax forskyvninger er nødvendig å dekomprimere/komprimere luften i thorax og er dermed ut av fase med nasal strømmen. Så, en økt TGV vil også øke forsinkelsen mellom kammer og øker dermed sRaw. Som kan sees, resultere både bronchoconstriction og økt TGV i en viktig innsats for å trekke luft inn i lungene. Dette er i hovedsak fysiologiske betydningen av sRaw. Det representerer arbeidet som kreves for å puste5,14.
Det er derfor viktig å forstå at to forskjellige faktorer påvirker sRaw: airway motstand og TGV. Faktisk kan sRaw uttrykkes som produktet av luftveiene motstand og TGV11. Bevisst dyr kan endre deres TGV på vilje, å tilpasse deres ventilasjon til et gitt miljø. Under slike forhold, der dyr naturlige fysiologiske tilstand er uendret, er det derfor umulig å skjelne om en endring i sRaw stammer fra en endring i airway motstand, fra en endring i TGV eller fra en blanding av to. Derfor er det anbefalt å utfylle DCP evalueringen med mer invasiv målinger av respiratoriske mekanikk og/eller lunge volumer, som dem som tilbys av FOT1,15.
Hittil har DCP brukt i ulike forskning programmer. Teknikken kan brukes med eller uten hode kammeret til kvantitativt og evaluere nøyaktig effekten av ulike stoffer, som farmasøytisk agenter, allergener, irritanter eller andre meglere, på lungefunksjon i bevisst smådyr 16,17,18. Fremre kammer kan også brukes som en utsette chamber aerosolized stoffer eller varierende gass konsentrasjoner (hypoksi, hypercapnia, etc.)19. Praktisk, det gjør det mulig å måle samtidig de akutte virkningene av disse eksponeringene. Faktisk er en av de felles bruk av DCP å vurdere graden av respons til aerosolized methacholine i forskjellige modeller av luftveissykdommer20,21,22,23, 24 , 25.
Selv om DCP teknikken er tilsynelatende enkle, noen praktiske utfordringer potensielt motvirke uerfarne brukere eller svekke nøyaktigheten og reproduserbarhet resultatene. Utredningen gir en detaljert beskrivelse av de anbefalte prosedyrene for å kunne registrere lungefunksjon av DCP i bevisst, behersket, spontant pustende mus. Beskrivelsen gjelder uttalte utstyret (se Tabell for materiale). Verktøyet og verdien av DCP er også demonstrert i en vanlig modell av allergiske lungebetennelse i to stammer mus testet ved baseline og som svar på aerosolized methacholine.
Muligheten til å måle lungefunksjonen i bevisst dyr er tydelig hjemlet i luftveiene forskning. Generelt, er DCP en interessant tilnærming til å evaluere funksjonen ventilasjon i luftveiene i bevisst og spontant puste dyr26. Mer spesifikt, slår DCP eller dens hodet ut variant, ofte en riktig balanse mellom kvaliteten på informasjonen og ønsket nivå av invasiveness3 (tabell 2). Teknikken kan tilpasses til ulike arter (f.eks mus, rotte, marsvin) eller dyr størrelser og kan brukes i mange forskning. Det er spesielt nyttig å vurdere flere dyr samtidig i en parallell studien design, overvåke funksjonen åndedretts gjentatte måte, og å fange the kinetics av svar over tid. I tillegg teknikken er enkel og kan læres i relativt rimelig tid. I dagens papir, en protokoll ansette DCP målinger i mus ble brukt som et eksempel å beskrive de praktiske aspektene av dette behersket plethysmography teknikken også for å diskutere viktige tiltak og relaterte resultater.
Når du arbeider med bevisst dyr, er det viktig å kontrollere forholdene i omgivelsene (f.eks rolig rom med et begrenset antall personer eller aktivitet) for å generere reproduserbar resultater. Siden restrainers kommer i ulike dimensjoner, er det viktig å starte med riktig størrelse, slik at puste bevegelsene er Uaffisert. Det er også nyttig og ofte nødvendig å acclimate dyrene eksperimentelle set-up og prosedyrer, som det er godt etablert i mus at påbud påvirker puste frekvens12. Avhengig av eksperimentell design eller betingelser, kan flere økter med trinnvis varighet være nødvendig. Til slutt er gir tid ved starten av et eksperiment for dyr å justere til rommet endres og nødvendig håndtering en enkel vurdering som viste seg å være effektive for å sikre at pustemønster er konsekvent regelmessig og avslappet ved baseline. Arbeide under forhold der dyrene er komfortable, godt tilpasset og rolig vil også være nyttig i forhold til resultatet variasjon og kvalitet. Det begrenser også noen stress-indusert utgivelsen av katekolaminer, som kan øke airway kaliber og dempe en indusert bronchoconstriction.
Det er viktig å forstå at det er behov for å skille som hermetisk som mulig nese og thoracic renn. Avhengig av systemet eller arter studerte, kan tetting mekanismen variere i form så vel som effekt. I DCP vi beskrevet her, opprettes segl mellom dyrets snute og begrensende enheten. Når vurdere lungefunksjon av DCP, er det også viktig å gi en tilstrekkelig og kontinuerlig bias flyt, som en reduksjon i nivået av oksygen tilgjengelig for dyret vil resultere i betydelige effekter. Tatt i betraktning for dyr i restrainer begrenser tilbøyelighet for luftlekkasjer opprettet av agitasjon og maksimerer dermed kvaliteten på dataene. Contrastingly, en bryter i seglet vil resultere i enten avviste datasett eller en undervurdering av noen parametere.
I tillegg for å aktivere separat innspillingen av nese flyt, brukes hodet kammeret vanligvis til å utsette dyr aerosolized stoffer. Som illustrert i denne artikkelen, kan dette brukes til å utføre en bronchoprovocation test for å demonstrere ulike grader av respons. I slike eksperimenter, justere utvalget av testet konsentrasjoner kan være nødvendig avhengig av arter, belastning, eller sex av dyrene studerte. Som tidligere viste8,9,10,27viser nåværende resultater at methacholine-indusert endringene i sRaw korrelert med invasiv FOT målinger av luftveiene motstand. Resultatene viser også at DCP teknikken ikke er så følsomme som FOT for sin evne til å oppdage åndedretts dysfunksjon og identifisere en endret respons lokalisert innenfor de nedre deler av lungekreft (lungevev og/eller små tilbehør airways) . Siden dyrets airways er intakt, kan tilstedeværelsen av de øvre luftveiene, som står for den største delen av totale åndedretts motstanden mot luftstrømmen28, påvirke aerosol distribusjon og deponering i tillegg å dempe bidraget fra lavere luftveiene til en måling. Tabell 3 oppsummerer andre forskjeller mellom DCP teknikken og FOT. Til slutt, mens det ville være teoretisk mulig å anslå dyrets totale airway motstand (inkludert øvre luftveier) fra en måling av sRaw, er det generelt anbefalt å utfylle DCP evalueringen med en invasiv måleverdien teknikken som FOT-29 å få direkte målinger av detaljert åndedretts mekanikk. Avhengig av målene for studien, kan målinger av øvre luftveier motstand også bli vurdert30,31,32.
Konklusjon
På grunn av sin begrensede grad av invasiveness er DCP en teknikk som kan oppfylle et viktig behov i luftveiene forskning. Det er kjøpedyktig skaffe nøyaktig readouts ventilasjon mønster i bevisst dyr samtidig med noen ubestridte indekser av luftveisobstruksjon. Innhentet informasjon også virkelig utfyller som fra mer invasiv tilnærminger.
The authors have nothing to disclose.
SML er støttet av en studentship fra kanadiske institutter for helseforskning, MG støttes av en bursary fra åndedretts helse nettverket av FRQS (Fonds de recherche du Québec-Santé) og YB er stipendiat fra FRQS.
FORFATTERNES BIDRAG
Alle forfattere bidratt til oppfatningen av manuskriptet og/eller video. SML og LD innsamlede dataene. SML, LD, YB, DM, DB og AR bidratt til dataanalyse, generering av tall og manuskriptet skriving. YB, AR, KL og MG var involvert i forbereder video skriptet. Stykket ble fremført av YB, KL og MG.
Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
Phosphate buffered saline | Multicell | 311-506-CL | PBS 10X |
House dust mite extract | GREER | 290902 | HDM |
DCP complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
iox software | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
flexiVent FX complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES |