Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa

Summary

Aqui nós descrevemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar imunológico fenotípico e funcional (indução de citocinas intracelulares) alterações nas amostras de sangue periférico, analisadas através de citometria de massa.

Abstract

Citocinas desempenham um papel crucial na patogênese de doenças auto-imunes. Daí, a medição dos níveis de citocina tem sido o foco de vários estudos na tentativa de compreender os mecanismos precisos que levam ao colapso da auto-tolerância e auto-imunidade subsequente. Abordagens, até agora tem sido baseadas no estudo de um aspecto específico do sistema imunológico (um único ou alguns tipos de células ou citocinas) e não oferecer uma avaliação global da doença auto-imune complexa. Enquanto o pacientes estudos baseados em soros tem conseguido importantes insights sobre auto-imunidade, eles não fornecem a fonte celular específica a desregulação citocinas detectadas. Uma abordagem abrangente de célula única para avaliar a produção de citocinas em vários subconjuntos de células imunes, dentro do contexto de "intrínseco" plasma paciente específico, fatores, de circulação é descrita aqui. Esta abordagem permite a monitoração do paciente específico imune fenótipo (marcadores de superfície) e função (citocinas), quer na sua nativa "intrínseco patogénicos" doença estadual, ou na presença de agentes terapêuticos (em vivo ou ex vivo).

Introduction

As doenças auto-imunes são das principais causas de morbidade e mortalidade, afetando 3-8% da população. Nos Estados Unidos, desordens auto-imunes estão entre as principais causas de morte entre as mulheres jovens e de meia-idade (idades < 65 anos)^1,2. Doenças auto-imunes são caracterizadas por apresentação clínica heterogênea e diversos processos imunológicos subjacentes. O espectro da heterogeneidade está bem representado através de diferentes transtornos, tais como a participação conjunta em artrite reumatoide (ar) e doença neurológica em esclerose múltipla (MS). No entanto, este nível de heterogeneidade ta....

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por o Colorado múltiplos institucional Review Board (COMIRB) da Universidade do Colorado. Todos os procedimentos descritos abaixo devem ser executados em uma capa de cultura de tecidos estéreis, salvo indicação em contrário, com pontas de pipetas filtrada, e todos os reagentes filtrada.

1. preparação dos reagentes para o processamento de sangue periférico

1. Prepare ruxolitinib estoque alíquotas (10 – 15 μL/frasco para uso individual) em 10mm diluindo o reagente liofilizado em DMSO, conforme as instruções do fabricante (loja a-80 ° C). Manter concentrações de DMSO em todos os ensaios, i....

Results

A Figura 1 demonstra o fluxo de trabalho para a estimulação e processamento das amostras de sangue periférico, incluindo a alocação das alíquotas de amostra de sangue, sincronismo da adição de agentes de estimulação, proteína de transporte inibidor cocktail e incubação vezes até o lysis da pilha de sangue vermelha (RBC) e fixação. A escolha dos agentes estimulantes dependerá as vias de sinalização e citocinas que são direcionadas para a avaliação. Por exemplo.......

Discussion

Aqui descrevemos um romance, unicelulares, abordagem proteômica para avaliar simultaneamente a vários tipos de células imunes e detectar suas várias citocinas perturbações no meio do paciente específico "" plasma de sangue periférico circulantes fatores patogênicos. Este método emprega o sangue periférico como o veículo analítico e citometria de massa como a ferramenta para a avaliação de anormalidades fenotípicas e funcionais de celulares imunes. O método é prontamente aplicável a estudos de humanos e ratos

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ruxolitinibe	Santa Cruz	SC-364729A	Estoque Conc: 10 mM; Conc final: 5 μ M
R848	Invivogen	tlrl-r848-5	Stock Conc: 1 μ g/μ L; Conc Final: 1 μ g/mL
LPS-EK	Invivogen	tlrl-eklps	Teor de Estoque: 1 μ g/μ L; Conc final: 0.1 μ g/mL
Estéril PBS	Lonza	17-516F
Lyse/Fix Buffer	BD biosciences	558049	Stock Conc: 5X; Conc Final: 1X (diluir em ddH2O)
BD Phosflow buffer de perm/lavagem I	BD biosciences	557885	Conc de Estoque: 10X; Conc final: 1:10 (diluído em ddH2O)
RPMI	Gibco	21870-076
Azida de sódio (NaN3)	Sigma-Aldrich	S-8032	Conc de estoque: >99,9%; Conc Final: 0.0002
Inibidor de Transporte de Proteína (PTI)	eBiosciences	00-4980-93	Conc de Estoque: 500X; Final Conc: 1X
DNA Intercalator	Fluidigm	201192B	Stock Conc: 500 μ M; Conc final: 0.1 μ
Meios de coloração de células M (CSM)			PBS + 0,5% BSA, 0,02% NaN3
MaxPar Barcode Perm	Buffer Fluidigm	201057	Stock Conc: 10X; Conc Final: 1X
Conjunto de Código de Barras Pd 20-plex	Fluidigm	S0014	Conc de Estoque: n/a; Cálculo Final: n/a
EQ TM Quatro Elementos Calibração de Esferas	Fluidigm	201078	Cálculo de Estoque: 10X; Conc Final: 1X
Solução de Formaldeído Livre de MeOH a 16%	Thermo	28908	Conc de Estoque: 16% (p/v); Conc final: 1,6% (p/v)
Tubos de poliestireno de fundo redondo estéril	VWR	60818-496	Conc de stock: n/a; Conc Final: n/a
Tubos de cluster de polipropileno	Light Labs	A-9001	Conc de estoque: n/a; Conc final: n/a
Helios Instrumento CyTOF	Fluidigm	Helios	Todas as soluções a serem usadas na análise CyTOF precisam estar livres de contaminação por metais. ddH2O é usado na preparação de qualquer solução deve ter uma resistividade de pelo menos 18,0 MΩ. cm. ddH2O e quaisquer soluções preparadas pelo próprio devem ser armazenadas em novos frascos de plástico ou vidro que nunca tenham sido autoclavados.
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpos usados para citometria de massa<
strong>Marcadores de superfície
CD1c	Biolegend	L161	Massa: 161
CD3	BD	UCHT1	Massa: 144
CD4	Biolegend	SK3	Massa: 174
CD7	BD	M-T701	Massa: 149
CD8	Biolegend	SK1	Massa: 142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	Massa: 209
CD11c	BD	B-ly6	Massa: 152
CD15	BD	HI98	Massa: 115
CD14	Biolegend	M5E2	Massa: 154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	Massa: 165
CD19	Santa Cruz	SJ25C1	Massa: 163
CD21	Biolegend	Bu32	Massa: 141
CD27	BD	L128	Massa: 155
CD38	Fluidigm	HIT2	Massa: 172
CD45 total	Biolegend	HI30	Massa: 89
CD45RA	Biolegend	HI100	Massa: 153
CD56	Miltenyi	REA196	Massa: 168
CD66	BD	B1.1/CD66	Massa: 113
CD86	Fluidigm	IT2.2	Massa: 150
CD123	Fluidigm	6H6	Massa: 143
CD278/ICOS	Biolegend	C398.4A	Massa: 156
CD179/PD1	Biolegend	EH12.2H7	Massa: 162
IgD	Biolegend	IA6-2	Massa: 146
IgM	Biolegend	MHM-88	Massa: 151
CXCR5	BD	RF8B2	Massa: 173
HLADR	Biolegend	L243	Massa: 167
Citocinas
IL-1&alfa;	Biolegend	364-3B3-14	Massa: 147
IL-1β	Biolenda	H1b-98	Massa: 169
IL-1RA	Santa Cruz	AS17	Massa: 157
IL-6	Biolegend	MQ2-13A5	Massa: 164
IL-8	BD	E8N1	Massa: 160
IL-12/IL-23p40	Biolegend	C8.6	Massa: 171
IL-17A	Biolegend	BL168	Massa: 148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23dcdp	Massa: 176
MIP1β	BD	D21-1351	Massa: 158
MCP1	BD	5D3-F7	Massa: 170
IFNα	Miltenyi	LT27:295	Massa: 175
IFN&gama;	Biolegend	4S. B3	Massa: 165
PTEN	BD	A2B1	Massa: 159
TNFα	Biolegend	Mab11	Massa: 166
Nota: Se o fabricante for declarado como Fluidigm, este anticorpo foi adquirido da Fluidigm com metal pré-conjugado. Se o fabricante for declarado como diferente do Fluidigm, este anticorpo foi autoconjugado usando a rotulagem MaxPar Multi-Metal  Kit (Fluidigm Cat: 201300) de acordo com o protocolo do fabricante.