유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사
Summary
여기, 우리 유도 대 한 프로토콜의 시리즈 및 경작된 한 세포에 세포 노화의 유효성 검사를 설명합니다. 우리는 다른 노화 유도 자극에 집중 하 고 일반적인 노화 관련 마커의 정량화를 설명. 우리 모델, 섬유 아 세포를 사용 하 여 기술 정보를 제공 하지만 프로토콜은 다양 한 휴대 전화 모델에 적용할 수 있습니다.
Abstract
세포 노화의 영구 세포 주기 검거 다른 손상 자극에 반응에서 활성화 상태입니다. 세포 노화의 활성화는 다양 한 병 태 생리 조건 종양 억제, 조직 리 모델링 및 노화 등의 특징입니다. Vivo에서 세포 노화의 inducers는 아직도 가난 하 게 특징 이다. 그러나, 자극의 수 ex vivo세포 노화 촉진 사용할 수 있습니다. 그 중 가장 일반적인 노화-inducers 일차 피로, 이온화 및 비 이온화 방사선, 차적인 약물, 산화 스트레스, 그리고 demethylating와 acetylating 대리인 있습니다. 여기, 우리가 노화에 섬유 아 세포를 유도 하는 것이 자극을 사용 하는 방법에 자세한 지침을 제공 합니다. 이 프로토콜은 쉽게 1 차 셀 및 셀 라인, 암 세포를 포함 하 여 다른 유형의 적용할 수 있습니다. 우리는 또한 노화 유도의 유효성 검사를 위해 다른 방법을 설명합니다. 특히, 우리는 lysosomal 효소 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-gal), 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (듀) 합동 분석 결과, 세포 주기 식의 레벨을 사용 하 여 DNA 합성의 속도의 활동을 측정에 초점 억제제 p16, p21, 식 그리고의 Senescence-Associated 분 비 형 (SASP)의 분 비. 마지막으로, 우리 예제에서는 결과 제공 하 고 이러한 프로토콜의 응용 프로그램을 추가 논의.
Introduction
1961 년, Hayflick와 무어 헤드 문화에 기본 fibroblasts 연속 구절1후 그들의 증식 잠재력을 잃고 보고. 이 프로세스는 각 세포 분열 후 telomeres의 순차 단축에 의해 발생 합니다. Telomeres 비판적으로 짧은 길이 도달, 그들은 활성화 확산의 돌이킬 수 없는 체포 하는 DNA 손상 응답 (DDR)에 의해 인식 됩니다-또한 일차 노 쇠로 정의. 일차 노화 현재 구분 mitogens와 apoptotic 신호2,3셀을 렌더링 하는 영구 세포 주기 검거의 상태를 유도 하는 것으로 알려져 있습니다 많은 자극 중 하나입니다. 노화 프로그램은 일반적으로 높은 lysosomal 활동, 미토 콘 드 리아 기능 장애, 핵 변화, chromatin 재배열, 바인딩과 그물 스트레스, DNA 손상 및 노화 관련을 포함 하 여 추가 기능 특징 분 비 형 (SASP)3,4. 노화 세포는 신체에 여러 기능을가지고: 개발, 상처 치유 및 종양 억제2. 똑같이, 그들은 노화와, 역설적으로, 종양 진행5에서 중요 한 역할을 알려져 있습니다. 노화의 부정, 그리고 부분적으로 모순 된 효과 종종 SASP6에 기인 된다.
최근에, 그것은 생쥐에서 노화 세포의 수명 연장 하 고 노화 기능7,,89,10,11, 의 많은 것의 제거에 지도 표시 했다 12. 같은 방식으로, 여러 약물 개발 되었습니다 하거나 노화 세포 (senolytics)를 제거 하거나 대상 SASP13,14. 안티 에이징 치료 잠재력 최근 분야에 더 많은 관심을 모으고 있다.
세포 노화에 관련 된 메커니즘의 연구 그리고 약리학 내정간섭에 대 한 검 진 무 겁 게 비보 전 모델, 특히 인간의 기본 fibroblasts에 의존. 노화 표현 형에 있는 큰 가변성 관찰 이며 셀 유형, 자극 및 시간 포인트3,15, 등 다양 한 요인에 따라 다양 한 노화 inducers에 의해 활성화 하는 몇 가지 일반적인 기능을 확인 하 고는, 16,17. 공부 및 노화 세포를 대상으로 고려 하는 것이 필수적입니다. 따라서,이 프로토콜 일련의 다른 치료를 사용 하 여 기본 섬유 아 세포에서 노화를 유도 하는 데 사용 하는 메서드를 제공 하는 것을 목표로. 로 설명 될 것입니다 방법을 쉽게 다른 셀 형식에 적용할 수 있습니다.
일차 노화 외에도 다른 5 노화 유도 치료 설명: 이온화 방사선, 자외선 (UV) 방사선, 독 소 루비, 산화 긴장 및 epigenetic 변화 (즉 histone acetylation 또는 DNA demethylation의 진흥) . 둘 다, 이온화 방사선 및 자외선 직접적인 DNA 손상 그리고, 적절 한 복용량에 트리거 노화18,19. 독 소 루비 또한 DNA 손상을 통해 주로 노화 DNA로 intercalating 하 여 원인과 topoisomerase II 기능을 방해 하 고 따라서 중단 DNA 수리 메커니즘20. 노화에 대 한 필수적인 유전자의 표현은 일반적으로 histone acetylation와 DNA 메 틸 화에 의해 제어 됩니다. 결과적으로, DNA demethylating (예를 들어, 5-아 자) 에이전트 및 히스톤 deacetylase 억제제 (예를 들면, 나트륨 낙 산 염 및 사 하) 그렇지 않으면 정상 세포21,22노화를 트리거합니다.
마지막으로, 노화 세포에 관련 된 가장 일반적인 마커의 4 설명 될 것 이다:는 노화 관련-β-galactosidase (SA-β-gal) 듀 합동 분석 결과, 세포 주기 규칙의 overexpression에 의해 DNA 종합의 비율의 활동 및 종속 kinase 억제제 p16, p21, 및 overexpression 멤버는 SASP의 분 비
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 설명 하는 프로토콜은 인간의 기본 섬유 아 세포, 최적화 된 특히 BJ와 WI-38 셀. 일차 노화, 전리 방사선, 독 소 루비에 대 한 프로토콜을 성공적으로 다른 세포 유형 즉 신생아 melanocytes와 keratinocytes (iPSC 파생 cardiomyocytes)과 섬유 아 세포 (HCA2 및 IMR90)의 다른 종류에 적용 우리의 실험실. 그러나, 몇 가지 세부 사항을 시드 셀, 방법 및 플라스틱 지원에 연결/분리에 대 한 셀 수 있도록 화학 물질의 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 유익한 토론에 대 한 관리자 실험실 및 데이터와 UV-유도 노화에 프로토콜을 공유 하기 위한 Thijmen 밴 Vliet의 회원을 감사 합니다.
Materials
| DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
Referências
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