Hier presenteren we een protocol om efficiënt isoleren primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid weefsels. Deze methode vereenvoudigt de conventionele procedure met behulp van de Y-27632 van de Inhibitor van de omwenteling ROCK in het medium van de inoculatie spontaan epidermale cellen uit dermale cellen scheiden.
Primaire menselijke keratinocyten van frisse huid weefsels en hun expansie in vitro geïsoleerd hebben wijd gebruikt voor laboratoriumonderzoek en klinische toepassingen. De isolatie van de conventionele methode van menselijke keratinocyten impliceert een sequentiële enzymatische spijsvertering-procedure in twee fasen, die heeft bewezen bij het genereren van primaire cellen van volwassen weefsels als gevolg van de lage cel terugvinding en de verminderde cel inefficiënt te zijn levensvatbaarheid. Onlangs meldden wij een geavanceerde methode om te isoleren van de menselijke primaire epidermale voorlopercellen van huid weefsels die gebruikmaakt van de Rho kinase inhibitor Y-27632 in het medium. Vergeleken met de traditionele protocol, deze nieuwe methode is eenvoudiger, makkelijker en minder tijdrovend, en verhoogt de cel van de stam van de epitheliale opbrengst en verbetert hun kenmerken van de cel van de stam. Bovendien, de nieuwe methodologie hoeft niet de scheiding van de epidermis van de dermis, en is daarom geschikt voor het isoleren van de cellen van verschillende types van volwassen weefsels. Deze nieuwe methode van de isolatie overwint de grote tekortkomingen van conventionele methoden en is meer geschikt voor de productie van grote aantallen epidermale cellen met hoge potentie zowel voor laboratorium klinische toepassingen. Hier beschrijven we de nieuwe methode in detail.
Het doel was het ontwikkelen van een eenvoudige en efficiënte protocol om te isoleren van de primaire mens keratinocyten (HKCs) uit volwassen weefsel, met name voor klinische toepassingen. Huid epidermal stamcellen, gelokaliseerd in de basale laag van de huid, bezitten een groot potentieel om te vermenigvuldigen en te onderscheiden en te voorzien van keratinocyten om de functies van de huid1,2,3, 4. HKCs geïsoleerd uit de huid weefsels veel voor huid weefsel engineering en regeneratie doeleinden, vooral in het herstel van beschadigde huid en in de therapie van het gen voor klinische toepassingen5,6 gebruikt worden. Het hoofdthema voor HKC gebaseerde toepassingen is efficiënt isoleren en uitbreiden van grote aantallen HKCs met hoge potentiële in vitro7,8. Hoewel verschillende onderzoeksgroepen hebben methodes voor de productie van culturen van stam-achtige HKCs ontwikkeld, zijn deze methoden soms tijdrovend en ingewikkeld uit te voeren en hebben andere beperkingen, zoals lage cel opbrengsten en wordt beperkt door het type van huid specimen 9gebruikt. Bijvoorbeeld, impliceert de traditionele methode om te isoleren van de HKCs van de huid weefsels een tweestaps enzymatische spijsvertering met een scheiding van de epidermis van de dermis6. Deze methode werkt meestal goed voor neonatale weefsels, maar het zeer moeilijk zijn wanneer gebruikt voor het isoleren van cellen uit volwassen weefsel wordt.
Y-27632, een inhibitor van de omwenteling van Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK), is gemeld aan het aanzienlijk verbeteren van de efficiëntie van de cel van de stam van de epidermale isolatie en kolonie groei10,11,12. In een eerdere studie ontdekten we dat Y-27632 de klonale groei van epidermale cellen vergemakkelijkt, maar het rendement van dermale cellen vermindert door het differentieel beheersen van de expressie van hechting moleculen13. Wij ook vastgesteld een nieuw geconditioneerde inoculatie medium, G-medium, ter ondersteuning van de groei en rendement van primaire epidermale cellen genoemd. Door het combineren van G-medium met Y-27632, kan deze nieuwe methode spontaan epidermale en dermale cellen scheiden na enzym spijsvertering, waardoor de stap van13,14van de scheiding van de epidermis-dermis. Op basis van eerdere verslagen, beschrijven we nu de gedetailleerde procedure voor deze nieuwe methode om te isoleren van de HKCs van volwassen huidweefsel.
Gekweekte primaire HKCs hebben grote schaal gebruikt voor de behandeling van wonden in klinieken voor meer dan drie decennia, en sinds die tijd, het is altijd belangrijk geweest voor efficiënt voldoende aantallen cellen voor klinische toepassingen te verkrijgen in een tijdige wijze. Daarom, in de praktijk, de conventionele isolatie-methode, waarbij de scheiding van de epidermis van de dermis, maakt het moeilijk om te voldoen aan deze eisen, als gevolg van de lage opbrengst van de cellen en het lage vermogen om de passag…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (2017YFA0104604), het algemene programma van nationale Natural Science Foundation van China (NSFC, 81772093), de wetenschap en de technologie ontwikkeling programma van Suzhou (ZXL2015128), de Natural Science Foundation van de oostelijke provincie Jiangsu (BK20161241), en een Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).
Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |