En forenklet og effektiv metode å isolere primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud vev
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å effektivt isolere primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud vev. Denne metoden forenkler konvensjonelle prosedyren ved hjelp av ROCK hemmer Y-27632 i inoculation medium spontant skille epidermal celler fra dermal celler.
Abstract
Primære menneskelige keratinocytter isolert fra frisk hud vev og deres ekspansjon i vitro har vært mye brukt for laboratorieundersøkelser og kliniske applikasjoner. Metoden konvensjonelle isolasjon av menneskelig keratinocytter innebærer en to-trinns sekvensiell enzymatisk fordøyelsen prosedyren, som har vist seg for å være ineffektive generere primære celler fra voksen vev lav celle utvinningsgrad og redusert celle levedyktighet. Vi har nylig rapportert en avansert metode å isolere menneskelige primære epidermal progenitor celler fra huden vev som benytter den Rho kinase inhibitor Y-27632 i medium. Sammenlignet med tradisjonelle protokollen, denne nye metoden er enklere, enklere og mindre tidkrevende, og øker epithelial stamcelleforskningen avkastning og forbedrer karakteristikkene stilk cellen. Videre den nye metodikken krever ikke separasjon av overhuden fra huden, og er derfor egnet for isolere celler fra ulike typer voksen vev. Denne nye isolasjon metoden overvinner de store manglene av konvensjonelle metoder og er mer egnet for å produsere store mengder epidermal celler med høy styrke både for laboratorier og kliniske applikasjoner. Her beskriver vi den nye metoden i detalj.
Introduction
Målet var å utvikle en enkel og effektiv protokoll for å isolere primære menneskelige keratinocytter (HKCs) fra voksen vev, spesielt for klinisk bruk. Huden epidermal stamceller, lokalisert i basale laget av huden, har et stort potensial til å spre og differensiere og gi keratinocytter for å beholde funksjonene av huden1,2,3, 4. HKCs isolert fra huden vev brukes for huden vev engineering og gjenfødelse, spesielt i reparasjon av skadet hud og i genterapi for klinisk bruk5,6. Hovedspørsmålet for HKC-baserte programmer er effektivt isolere og utvide stort antall HKCs med høyt potensial i vitro7,8. Selv om forskjellige forskningsgrupper har utviklet metoder for å produsere kulturer av stilk-lignende HKCs, er disse metodene ofte tidkrevende og komplisert å utføre og har andre begrensninger, som lav celle avkastning og å være begrenset av huden prøven brukt9. For eksempel innebærer den tradisjonelle metoden å isolere HKCs fra hudvevet en Totrinns enzymatisk fordøyelsen med en separasjon av overhuden dermis6. Denne metoden fungerer vanligvis bra for neonatal vev, men det blir svært vanskelig når isolere celler fra voksen vev.
Y-27632, en inhibitor av Rho-assosiert protein kinase (ROCK), har blitt rapportert å betydelig forbedre effektiviteten av epidermal stamcelleforskningen isolasjon og kolonien vekst10,11,12. I en tidligere studie oppdaget vi at Y-27632 forenkler klonal veksten av epidermal celler, men reduserer avkastningen av dermal celler med ulikt kontrollere uttrykket av vedheft molekyler13. Vi har også etablert et nytt betinget inoculation medium, kalt G-medium, som støtter vekst og avkastning på primære epidermal celler. Ved å kombinere G-medium med Y-27632, kan denne romanen metoden spontant skille epidermal og dermal celler etter enzym fordøyelsen, dermed fjerne trinnet overhuden-dermis separasjon13,14. Basert på tidligere rapporter, beskrive vi nå den detaljert prosedyren av denne nye metoden å isolere HKCs fra voksen hud vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kultivert primære HKCs har blitt mye utnyttet for å behandle sår i klinikker i mer enn tre tiår, og siden den gangen, det er alltid viktig å effektivt få tilstrekkelig antall celler for klinisk bruk i tide. Derfor, i praksis metoden konvensjonelle isolasjon som krever separasjon av overhuden fra huden, gjør det vanskelig å møte disse kravene, på grunn av lav avkastningen av celler og lav evnen å passasje voksen celler. Her beskriver vi en ny enkel metode vi utviklet å effektivt hente HKCs fra voksen vev baser…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (2017YFA0104604), General programmet av National Natural Science Foundation i Kina (NSFC, 81772093), vitenskap og teknologi utvikling programmet Suzhou (ZXL2015128), Natural Science Foundation av Jiangsu provinsen (BK20161241), og en Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
Referências
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells – role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
