En förenklad och effektiv metod att isolera primära mänskliga keratinocyter från vuxen hudvävnad
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att effektivt isolera primära mänskliga keratinocyter från vuxna huden vävnader. Denna metod förenklar förfarandet för konventionella genom att spontant skilja epidermala celler från dermal celler med den ROCK hämmare Y-27632 inympning medium.
Abstract
Primära mänskliga keratinocyter isolerade från friska huden vävnader och deras expansion i vitro har använts för laboratorieforskning och kliniska tillämpningar. Metoden konventionell isolering av mänskliga keratinocyter innebär ett tvåstegsförfarande sekventiell enzymatisk nedbrytning, som har visat sig vara ineffektiva i att generera primära celler från vuxna vävnader på grund av den låga cell återvinningsgrad och minskad cell lönsamhet. Vi rapporterade nyligen en avancerad metod att isolera människans primära epidermal stamceller från hudvävnader som utnyttjar den Rho tyrosinkinashämmare Y-27632 medium. Jämfört med traditionella protokollet, denna nya metod är enklare, lättare och mindre tidskrävande, och ökar epitelial stamceller avkastning och ökar deras stamceller egenskaper. Dessutom den nya metoden kräver inte separation av överhuden från läderhuden, och, därför, är lämplig för att isolera cellerna från olika typer av vuxna vävnader. Denna nya metod för isolering övervinner de stora bristerna i konventionella metoder och är mer lämplig för att producera stora mängder epidermala celler med hög potens både laboratorium och kliniska tillämpningar. Här beskriver vi den nya metoden i detalj.
Introduction
Målet var att utveckla ett enkelt och effektivt protokoll för att isolera primära mänskliga keratinocyter (HKCs) från vuxna vävnader, särskilt för kliniska tillämpningar. Epidermal hudstamceller, lokaliserade i de basala lagret av huden, besitter en hög potential att föröka sig och differentiera och tillhandahålla keratinocyter för att bibehålla funktionerna av hud1,2,3, 4. HKCs isolerade från huden vävnader används allmänt för huden vävnad engineering och regenerering, särskilt i reparation av skadad hud och genterapi för kliniska tillämpningar5,6. Nyckelfrågan för HKC-baserade program är att effektivt isolera och expandera stort antal HKCs med hög potential in vitro7,8. Även om olika forskargrupper har utvecklat metoder för att producera kulturer av stem-liknande HKCs, är dessa metoder ibland tidskrävande och komplicerat att utföra och har andra begränsningar, såsom lågt avkastning och begränsas av typ av huden preparatet använde9. Till exempel innebär den traditionella metoden att isolera HKCs från hudvävnader en två-stegs enzymatisk nedbrytning med en separation av överhuden från läderhuden6. Metoden fungerar oftast bra för neonatal vävnader, men det blir mycket svårt när den används att isolera celler från vuxna vävnader.
Y-27632, en hämmare av Rho-associerade proteinkinas (ROCK), har rapporterats att väsentligt öka effektiviteten av epidermal stem cell isolering och kolonin tillväxt10,11,12. I en tidigare studie upptäckte vi att Y-27632 underlättar klonal tillväxt av epidermala celler men minskar avkastningen av dermal celler av differentially kontrollerar uttrycket av vidhäftning molekyler13. Vi har också etablerat ett nytt luftkonditionerade inympning medium, kallas G-medium, som stöder tillväxt och avkastning av primära epidermala celler. Genom att kombinera G-medium med Y-27632, kan denna nya metod spontant separera dermala och epidermala celler efter enzym matsmältningen, därmed undanröja steget epidermis-dermis separation13,14. Baserat på tidigare rapporter, beskriver vi nu detaljerade förfarandet för denna nya metod att isolera HKCs från vuxen hudvävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Odlade primära HKCs allmänt har använts för att behandla sår i kliniker för mer än tre decennier och, sedan den tiden, det har alltid varit viktigt att effektivt skaffa tillräckligt antal celler för kliniska tillämpningar i tid. Därför i praktiken gör metoden konventionell isolering, som kräver separation av överhuden från läderhuden, det svårt att uppfylla dessa krav, på grund av den låga avkastningen av celler och låg förmåga att passage vuxna celler. Här beskriver vi en ny enkel metod vi utveck…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete var stöds av nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (2017YFA0104604), General programet av National Natural Science Foundation Kina (NSFC, 81772093), vetenskap och teknik Development Program av Suzhou (ZXL2015128), Naturvetenskap Foundation i Jiangsuprovinsen (BK20161241), och en Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
Referências
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells – role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
