الاعتداء على أساس البيوتين المنسدلة للتحقق من صحة مرناً ميرناس "الأهداف الخلوية"
Summary
ويصف هذا التقرير طريقة سريعة وموثوق بها للتحقق من صحة الأهداف مرناً من ميرناس الخلوية. يستخدم أسلوب يحاكي ميرنا بيوتينيلاتيد الاصطناعية على أساس تأمين LNA “الحمض النووي” لالتقاط الهدف مرناً. بعد ذلك، تستخدم المغلفة streptavidin الخرز المغناطيسي المنسدلة الهدف مرناً للقياس الكمي ب qPCR تفاعل البوليميراز المتسلسل.
Abstract
ميكرورناس (ميرناس) هي فئة من الكشف فضله الصغيرة التي بوستترانسكريبتيونالي تنظيم تعبير الجينات الخلوية. ربط ميرناس إلى 3 ‘ غير مترجمة المنطقة (UTR) لاستهداف مرناً تحول دون ترجمة البروتين أو في بعض الحالات يتسبب في تدهور مرناً. ربط ميرنا إلى 3 ‘UTR الهدف هو بتسلسل بذور النوكليوتيدات 2-8 في 5’ نهاية ميرنا وساطة مرناً. على الرغم من دور ميرناس كجزيئات التنظيمية الخلوية، تحديد مرناس المستهدفة ذات الصلة الوظيفية لا يزال يمثل تحديا. وقد استخدمت أدوات Bioinformatic للتنبؤ بتسلسل داخل 3 ‘ UTR من مرناس كأهداف محتملة لربط ميرنا. كما استخدمت هذه الأدوات لتحديد حفظ التطوري لهذه التسلسلات بين الأنواع ذات الصلة في محاولة للتنبؤ بدور وظيفي. ومع ذلك، هذه الطرق الحسابية غالباً ما توليد نتائج إيجابية زائفة وتقتصر على التنبؤ بالتفاعل المقبول بين ميرنا ومرناً. ولذلك، إجراءات تجريبية تقيس الربط المباشر لميرنا إلى هدفها مرناً ضرورية لإقامة التفاعل الوظيفي. وفي هذا التقرير، يصف لنا طريقة حساسة للتحقق من التفاعل المباشر بين ميرنا الخلوية مير-125b و 3 ‘ مرناً UTR نشطت-1. يمكننا وضع بروتوكول الذي تم transfected يقلد ميرنا بيوتينيلاتيد الاصطناعية في خلايا الثدييات وتهدمه المجمع ميرنا مرناً في الخلوي ليساتي مع الخرز المغناطيسي المغلفة ستريبتافيدين. وأخيراً، الهدف كان كمياً مرناً في سحبها إلى أسفل الحمض النووي المعقدة باستخدام استراتيجية قائمة على قبكر.
Introduction
ميكرورناس (ميرناس) صغيرة غير الترميز الكشف التي تنظم سلبا على بروتين التعبير1. سلائف ميرنا الموجودة في مجموعات من خلال العديد من مناطق الجينوم، معظم الأحيان داخل المناطق إينتيرجينيك وإينترونس من البروتين ترميز الجينات2،3. نشوء حيوي ميرناس تشمل النسخ من الحزب الثوري المؤسسي-ميرناس من ميرنا-ترميز الجينات4. الحزب الثوري المؤسسي-ميرناس الخضوع لمعالجة متسلسلة، أولاً في النواة، ومن ثم في السيتوبلازم لتوليد واحد الذين تقطعت بهم السبل ميرناس ناضجة4،5. بعد ذلك، أدرجت ميرناس ناضجة في المجمع إسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي (RISC): مجمع بروتين-الجيش الملكي النيبالي مولتيميريك التي تضم عضوا من عائلة البروتينات لهدف الاعتراف4،5، أرجوناوتي 6،7. ميرناس ناضجة في RISC معقدة الغالب ربط 3 ‘UTR الهدف مرناس8،،من910 ، لكن يمكن أيضا ربط أحياناً في الترميز والمنطقة UTR 5′ مرناً10،11 . ربط ميرنا مرناً تسلسل النتائج في إسكات متعدية12،،من1314 ، وفي بعض الحالات مرناً زعزعة15. حيث يمكنك استهداف ميرنا واحد مرناس كثيرة، يشاركون في العملية الخلوية تقريبا كل هذه الجزيئات التنظيمية وقد تورطت في المرض مختلف الظروف16،17،18.
فهم تفصيلي لكيفية تنظيم ميرناس المسارات الخلوية يتطلب تحديد مرناس المستهدفة. تتوفر أنظمة المعلوماتية متعددة للتنبؤ miRNA:mRNA المفترضة التفاعلات19،20. تعتمد هذه التوقعات على الكمال واتسون-كريك إقران قاعدة بين النوكليوتيدات 2 – 8 تسلسل البذور ميرنا وتسلسل تكميلية ضمن الهدف مرناً4،21. بالإضافة إلى ذلك، هذه الأدوات إنشاء هيكل مزدوج miRNA:mRNA الثانوي وحساب معلمات دينامي حراري لهذا التفاعل الجزيئي وإظهار المحافظة على مواقع الربط عبر الأنواع تعزيز صلة وظيفية للهدف التنبؤ. لسوء الحظ، هذه الأدوات أيضا أن يكون الحد من التنبؤ بأهداف إيجابية كاذبة في15،معدل مرتفع جداً (~ 27-70 ٪)22. الأهم من ذلك، تفشل هذه المنصات في السيليكون الاعتراف غير المقبول تفاعلات ميرناس مع تلك الأهداف23. ولذلك، هذه التحليلات التنبؤية هي غالباً جنبا إلى جنب مع طرق تجريبية للتحقق من صحة الأهداف ذات الصلة وظيفيا.
وضعت نهوج متعددة للتحقق تجريبيا من التفاعل miRNA:mRNA. التجارب الجينية باستخدام يقلد ميرنا، والإسفنج والموانع التي تغير مستويات ميرناس في الخلية توفر القرائن لأثره التنظيمية في الهدف الجينات التعبير24،،من2526. بالإضافة إلى ذلك، مراسل على أساس فحوصات عبر تعداء المشارك لاستنساخ تحتوي على 3 ‘ UTR منطقة يقلد مرناً وميرنا المستهدفة أو مثبطات في خلايا تقديم الأدلة للوظيفة الرقابية ميرناس26. في حين أن هذه الأساليب حاسمة لدراسة تنظيم التعبير الجيني بوستترانسكريبشونال من ميرناس، تعداء الكفاءة وبليوتروبيك آثار التغيرات في مستويات ميرنا الخلوية هي القيود الرئيسية من هذه النهج الوراثية23، 26. ولذلك تستخدم الطرق البيوكيميائية التكميلية التي التحقيق التفاعل المباشر بين ميرنا وهدفها فهم أفضل لوظيفة الخلوية ميرناس.
أسلوب واحد يستخدم على نطاق واسع لدراسة التفاعل المباشر بين ميرنا وهدفها إيمونوبريسيبيتيشن RISC معقدة متبوعاً بكشف الهدف مرناً داخل مجمع27،،من2829،30 . في الآونة الأخيرة، استخدمت أيضا طريقة مصيدة RISC محسنة لتحديد أهداف ميرنا؛ الأزواج استقرار الأهداف داخل وسيطة RISC-ميرنا-مرناً مع تنقية الأهداف مرناً. ومع ذلك، ميثودسفيس هذه التحديات الملازمة للتفاعلات غير محددة بين الجيش الملكي النيبالي والجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات التي عادة ما يتم فصل من مقصورات الهاتف الخلوي31،32. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الاختبارات التي تعتمد على وجود بروتين AGO2 إيمونوبريسيبيتيشن من مجمع RISC33. نظراً لأن AGO2 لا أرجوناوتي فقط للتوسط في التفاعلات miRNA:mRNA فعالة، يمكن أن يؤدي استبعاد الأخرى أرجوناوتيس إلى نتائج متحيزة34. ولذلك، هناك حاجة إلى استراتيجيات بديلة لدراسة الربط المباشر لميرنا مرناً.
في هذا التقرير، يمكننا وضع نهج خطوة واحدة ليحقق التفاعل المباشر بين ميرنا وهدفها مرناً. أولاً، يتم ترانسفيكتيد 3 ‘ بيوتينيلاتيد مؤمن يقلد ميرنا الحمض النووي (LNA) في خلايا الثدييات. ثم، يتم التقاطها miRNA:mRNA المعقدة في الخلوية ليستي استخدام الخرز المغناطيسي streptavidin المغلفة. الهدف مرناً منضم إلى ميرنا مكملة لها هو كمياً باستخدام قبكر.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحديد أهداف مرناً من ميرناس الخلوية مهم لفهم وظيفتها التنظيمية. وتستخدم العديد من الأدوات الحسابية للتنبؤ بأهداف تستند إلى تكامل تسلسل البذور والمحافظة على الهدف تسلسل19،20. على الرغم من أن هذه الأدوات قيمة، أنها يمكن أن تولد مستويات عالية من كاذبة إيجابيات…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده هذا العمل جزئيا DA037779 منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (إلى جي بي)، DA024558، DA30896، DA033892، DA021471، AI22960، و MD007586 (إلى ماديرا). العمل الذي أيده أيضا ركمي منحة G12MD007586، UL1RR024975 منحة كتسا فاندربيلت، منح مركز أبحاث يشغل ميهاري (مترك) كتسا (RR026140 U54 من نكر/المعاهد الوطنية للصحة، و MD007593 منحة U54 من نيمهد/المعاهد الوطنية للصحة، ووسط ولاية تينيسي للإيدز البحوث (P30 AI110527).
Materials
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
Referências
- Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
- Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
- Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
- Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5′-UTR and 3′-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
- Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
- Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
- Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
- Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
- Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
- Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
- Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
- Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
- Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
- Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
- Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340 (2015).
- Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
- Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
- Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
- Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
- Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
- Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
- Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
- Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
- Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents?. BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
- Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
- Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
- Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
- Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
- Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
- Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer’s disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
- Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
- Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
- Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3′-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
- Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Bioquímica. 50, 9352-9367 (2011).
