Biotin-baserte Pulldown analysen å validere mRNA mål av mobilnettet miRNAs
Summary
Denne rapporten beskriver en rask og pålitelig metode for å validere mRNA mål av mobilnettet miRNAs. Metoden bruker syntetiske biotinylated låst nukleinsyre LNA-baserte miRNA etterligner for å fange mål mRNA. Deretter streptavidin-belagt magnetiske perler er ansatt å pulldown målet mRNA for kvantifisering av qPCR polymerasekjedereaksjons.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er en klasse av små noncoding RNAs som post-transcriptionally regulerer mobilnettet genuttrykk. MiRNAs binde til 3 uoversatt regionen (UTR) mot mRNA hemme protein oversettelse eller i noen tilfeller føre mRNA degradering. Binding av miRNA til den 3-‘ UTR i av målet mRNA er formidlet av en 2-8 nukleotid frø sekvens nederst 5’ miRNA. MiRNAs rolle som mobilnettet regulatoriske molekyler er godt etablert, identifikasjon av målet mRNAs med funksjonell relevans er fortsatt en utfordring. Bioinformatic verktøy har vært ansatt å forutsi sekvenser fra den 3-‘ UTR i av mRNAs som potensielle mål for miRNA bindingen. Disse verktøyene har også blitt benyttet for å fastslå evolusjonære bevaring av slike sekvenser blant beslektede arter i et forsøk på å forutsi funksjonelle rolle. Men metodene beregningsorientert ofte generere falske positive resultater og er begrenset til forutsi kanoniske samspillet mellom miRNA og mRNA. Eksperimentell prosedyrer som måler direkte binding av miRNA til mRNA målet er derfor nødvendig å etablere funksjonell interaksjon. I denne rapporten beskriver vi en følsom metoden for validering av direkte samspill mellom mobilnettet miRNA miR-125b og de 3’ UTR av PARP-1 mRNA. Vi utdype en protokoll som syntetisk biotinylated-miRNA imiterer var transfekterte i pattedyrceller og miRNA-mRNA komplekset i mobilnettet lysate ble revet med streptavidin-belagt magnetiske perler. Endelig målet mRNA i trakk ned nukleinsyre komplekse ble kvantifisert ved hjelp av en qPCR-basert strategi.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) er små ikke-koding RNAs som negativt regulerer protein uttrykk1. Forløpere for miRNA ligge i gjennom mange regioner i genomet, oftest innen intergenisk regioner og introns protein-koding gener2,3. Biogenesis av miRNAs involverer transkripsjon av pri-miRNAs fra miRNA-koding gener4. Pri-miRNAs gjennomgå sekvensiell behandling, først i kjernen og deretter i cytoplasma generere enkelt strandet moden miRNAs4,5. Senere, de eldre miRNAs er innlemmet i RNA-indusert stanse komplekset (RISC): en multimeric protein-RNA kompleks som inkluderer medlem av Argonaute proteiner målet anerkjennelse4,5, 6,7. Eldre miRNAs i RISC komplekse hovedsakelig binde til den 3-‘ UTR i målet mRNAs8,9,10 , men kan også binde noen ganger i koding og 5′ UTR regionen av mRNA10,11 . Binding av miRNA til mRNA sekvenser resultater i translasjonsforskning stanse12,13,14 og i noen tilfeller mRNA destabilisering15. Siden en enkelt miRNA kan målrette mange mRNAs, disse regulatoriske molekylene er involvert i nesten alle mobilnettet prosessen og har vært innblandet i ulike sykdom betingelser16,17,18.
Detaljert forståelse av hvordan miRNAs regulere cellular stier krever identifikasjon av målet mRNAs. Flere bioinformatikk plattformer er tilgjengelige til å forutsi mulige miRNA:mRNA vekselsvirkningene19,20. Disse spådommene stole på perfekt Watson-Crick base sammenkoblingen mellom 2-8 nukleotid frø sekvensen av miRNA og en utfyllende sekvens i målet mRNA4,21. I tillegg disse verktøyene generere sekundære strukturen i miRNA:mRNA duplex, beregne termodynamisk parametere av dette molekylær samspillet og vise bevaring av bindende områder over arter å forbedre funksjonelle relevansen av målet prediksjon. Dessverre har disse verktøyene også begrensning av forutsi falske positive mål på et svært høy hastighet (~ 27-70%)15,22. Viktigst, mislykkes disse i sili plattformer i å gjenkjenne miRNAs ikke-kanoniske samhandling med deres mål23. Derfor er slike forutsigende analyser ofte kombinert med eksperimentelle metoder for å validere funksjonelt relevante mål.
Flere tilnærminger har blitt utviklet for å validere eksperimentelt miRNA:mRNA interaksjon. Genetiske eksperimenter med miRNA etterlikner, gir svamper og hemmere som endrer nivåer av miRNAs i cellen ledetråder for sin regulerende effekt på målet gene expression24,25,26. I tillegg reporter basert analyser via co transfection av en klone som inneholder 3 UTR regionen målet mRNA og miRNA imiterer eller hemmere i celler beviser regulatoriske funksjonen miRNAs26. Disse metodene er avgjørende for å studere post-transcriptional regulering av genuttrykk av miRNAs, er hva effektivitet og pleotropic effekter av endringer i mobilnettet miRNA nivåer store begrensninger av disse genetiske tilnærminger23, 26. Derfor er komplementære biokjemiske metoder som probe direkte samspill mellom miRNA og målet ansatt å forstå funksjonen mobilnettet i miRNAs.
En brukte metoden å studere direkte samspill mellom miRNA og målet er immunoprecipitation av RISC sammensatt fulgt av gjenkjenning av mRNA målet innen den komplekse27,28,29,30 . Nylig ble en forbedret RISC felle metode også benyttet for å identifisere miRNA mål; det par stabilisering av mål innen RISC-miRNA-mRNA intermediates med rensing av mRNA mål. Men disse methodsface uspesifisert samspillet mellom RNA og RNA-bindende proteiner som vanligvis er segregerte av mobilnettet rom31,32iboende utfordringer. I tillegg er disse analyser avhengig av tilstedeværelse av AGO2 protein for immunoprecipitation RISC komplekse33. Gitt at AGO2 ikke er den eneste argonaute å megle effektiv miRNA:mRNA vekselsvirkningene, kan utelukkelse av andre argonautes føre til forutinntatte resultater34. Derfor for alternative strategier å studere direkte binding av miRNA til mRNA.
I denne rapporten vi utdype en ett-trinns tilnærming for utprøvende direkte samspill mellom en miRNA og målet mRNA. Først 3 biotinylated låst nukleinsyre (LNA) miRNA imiterer er transfekterte i pattedyrceller. Deretter fanges miRNA:mRNA i mobilnettet lysate bruker streptavidin belagt magnetiske perler. MRNA målet bundet til sin komplementære miRNA er kvantifisert ved hjelp av qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identifikasjon av mRNA målene for mobilnettet miRNAs er viktig for å forstå deres regulatoriske funksjon. Flere beregningsorientert verktøy er ansatt å forutsi mål basert på frø sekvens komplementaritet og bevaring av målet sekvenser19,20. Selv om disse verktøyene er verdifulle, kan de generere høye nivåer av både falske positiver og feilaktige negativer. Derfor er disse spådommene kombinert med eksperimentelle metoder som immunoprecipitation av RIS…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd DA037779 (å J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 og MD007586 (å CD). Arbeidet ble også støttet av RCMI Grant G12MD007586, Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, gi Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA (U54 RR026140 NCRR/NIH, U54 Grant MD007593 fra NIMHD/NIH og Tennessee senter for AIDS Forskning (P30 AI110527).
Materials
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
Referências
- Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
- Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
- Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
- Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5′-UTR and 3′-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
- Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
- Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
- Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
- Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
- Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
- Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
- Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
- Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
- Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
- Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
- Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340 (2015).
- Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
- Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
- Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
- Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
- Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
- Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
- Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
- Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
- Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents?. BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
- Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
- Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
- Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
- Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
- Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
- Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer’s disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
- Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
- Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
- Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3′-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
- Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Bioquímica. 50, 9352-9367 (2011).
