TreadWheel: Intervall Trainingsprotokoll sanft induzierte Bewegung in Drosophila melanogaster

Summary

Die TreadWheel nutzt Drehbewegung induzieren sanft Übung in Erwachsenen Drosophila Melanogaster durch Ausnutzung fliegen Angeborene, negative Geotaxis. Es ermöglicht für die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Bewegung und Faktoren wie Genotyp, Geschlecht und Ernährung und ihre Auswirkungen auf die physiologischen und molekularen Tests, metabolische Gesundheit festzusetzen.

Abstract

Die Inzidenz von komplexen Stoffwechselerkrankungen hat durch einen weit verbreiteten Übergang zu Lebensstile der erhöhten Kalorienzufuhr und gesenkte Aktivität erhöht. Diese multifaktoriellen Krankheiten entstehen aus einer Kombination von genetischen, Umwelt- und verhaltensbezogenen Faktoren. Es ist eine so komplexe Erkrankung metabolischen Syndroms (MetS), die eine Gruppe von Stoffwechselerkrankungen, wie Hypertonie, Hyperglykämie und abdominale Adipositas ist. Bewegung und diätetische Intervention sind die primären Behandlungen von Ärzten empfohlen, um Übergewicht und seine spätere Stoffwechselerkrankungen zu mildern. Übung Intervention, insbesondere aerobes Intervalltraining stimuliert günstige Änderungen in die gemeinsame Risikofaktoren für Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM), Herz-Kreislauf-Krankheit (CVD) und anderen Bedingungen. Mit dem Zustrom von beweisen hat, beschreibt die therapeutische Wirkung Übung auf metabolische Gesundheit, die Einrichtung ein Systems, das Modelle in einer kontrollierten Umgebung ausüben bietet ein wertvolles Instrument für die Beurteilung der Auswirkungen der Übung in einem experimentellen Kontext. Drosophila Melanogaster ist ein großes Werkzeug für die Untersuchung der physiologischen und molekularen Veränderungen, die durch Übung Intervention entstehen. Die fliegen haben kurze Laufzeiten und ähnliche Mechanismen der metabolisierenden Nährstoffe im Vergleich zu Menschen. Übung in Drosophilainduzieren, entwickelten wir eine Maschine namens TreadWheel, die die Fliege Angeborene, negative Geotaxis Tendenz induzieren sanft Klettern nutzt. Dies ermöglicht Forschern Experimente auf großen Kohorten von genetisch vielfältigen fliegen um den Genotyp-durch-Umwelt-Interaktionen zugrunde liegt die Effekte der Übung auf metabolische Gesundheit besser zu verstehen.

Introduction

Kindheit und Erwachsenen Übergewicht wachsen Epidemien in Kulturen, die verbrauchen hohe kalorischer Diäten und untätig bleiben über einen längeren Zeitraum hinweg, was zu schweren Spätfolgen, einschließlich Insulin-Resistenz, chronische Entzündungen und Arthrose führen kann ^{1 , 2 , 3 , 4}. die Prävalenz dieser Erkrankungen steigt weiter durch das wachsende Ungleichgewicht Kalorienzufuhr und Ausgaben erhöhten Konsum von Fetten und Zucker und eine überwiegend sitzende Lebensweise⁵zugeschrieben. Dementsprechend hat diese Energie-Ungleichgewicht zu einer Zunahme der Fälle von Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM) und Herz-Kreislauf-Krankheit (CVD)⁵geführt. Personen sind ein höheres Risiko für beide Erkrankungen zu entwickeln, wenn sie mit der Erkrankung metabolischen Syndroms (MetS), abdominale Adipositas und Dyslipidämie²Symptome diagnostiziert wurde. MetS ist geprägt durch die komplexen Wechselwirkungen zwischen Genotyp und verschiedene Umweltfaktoren, wie Diät und Übung⁶. Also, um ein umfassendes Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen dieser komplexen Erkrankung zu gewinnen, all diese Faktoren berücksichtigen.

Wenn es darum geht, die Bekämpfung der MetS, empfehlen Ärzte zuerst unterziehen Veränderungen im Lebensstil, die enthalten, Essen eine gesunde, ausgewogene Ernährung und körperliche Aktivität^2,7,8. Da wirksame Medikamente begrenzt sind und Magenbypass-Operation ist teuer und erfordert eine lebenslange medizinische Überwachung, pharmakologische und chirurgische Eingriffe nur bei schweren Fällen und nur in Verbindung mit diesen Änderungen des Lebensstils^{3 empfiehlt ,7,8}. Während lebensstilinterventionen, wie z. B. Bewegung und Diät, können produzieren und langfristige Ziele Gewichtsverlust pflegen, müssen unabhängig davon, ob diese Korrekturmaßnahmen vollständig die negativen Auswirkungen im Zusammenhang mit MetS lindern können weitere Studie^{7, 8}.

Maus-Modellen wurden verwendet, um die Auswirkungen der Übung auf Stoffwechselerkrankungen jahrelang untersuchen; die Einführung der Übung Forschung auf MetS zu fliegen ist jedoch ein relativ neues Unterfangen^9,10,11,12. Fliegen bieten das perfekte Fahrzeug, um die Übung in einer kontrollierten Laborumgebung studieren da sie leicht zu manipulieren sind, haben eine kurze Lebensdauer, sind preiswert im Unterhalt und energetischen Stoffwechselwege sind hoch konserviert zwischen Drosophila und Menschen¹³. D. Melanogaster Genom sind gut charakterisiert, und gibt es eine Fülle von Genetik-Tools für den Einsatz in Drosophila , die bieten Einblick in die verschiedenen Genotypen und Genotyp-durch-Umwelt-Interaktionen, die modulieren könnten die Wirkung der Übung auf organismal Gesundheit¹⁴.

Aktuelle Methoden der Ausübung Drosophila Aufrufen der Fliege Angeborene, negative Geotaxis Tendenz, die Verhaltensstörungen Instinkt, nach oben zu klettern, zu stimulieren, Klettern bei Erwachsenen in ihren Gehegen^11,12,15 . Der Power Tower, eine Methode, um Übung im fliegen, stimulieren systematisch wirft die Fliege Gehäuse vertikal und dann fällt sie zurück auf die Arbeitsfläche effektiv klopfen die fliegen auf den Boden des Fläschchens, und veranlassten ihre instinktive negative geotaxis ^{12 , 16}. Experimente mit dieser Maschine hat gezeigt, dass Bewegung ein leistungsfähiges Schutzfaktor gegen viele altersbedingte Krankheiten ist, einschließlich CVD und T2DM, und gesundes Altern^{12,17,18 fördert} . Insbesondere zeigten sie, dass Übung kann das Auftreten von altersbedingten Mobilität Rückgang der fliegen verringern und mehrere altersbedingten Symptome wie Herzleistung verbessern und stress Antwort^17,18. Allerdings fliegt Kontrolle nie auf dem Turm zeigte höhere Klettern Werte als derjenigen, die mit der Maschine, was darauf hindeutet, dass die Kraft der sich wiederholenden Tropfen fliegen verletzen kann und die Auswirkungen auf Mobilität¹²platziert. Dies deutet darauf hin, dass eine alternative Methode zur Induktion Übung, ist weniger kraftvoll und vermeidet körperliches Trauma verursacht, eine nützlich, ergänzende Methode, um den Power Tower Protokoll¹⁶wäre.

Um sanft induzieren Übung in Drosophila, entwickelten wir eine Übung Maschine namens TreadWheel (Abbildung 1). Die TreadWheel ist (fortan als TW abgekürzt) Drehbewegung löst die fliegen Angeborene, negative Geotaxis Tendenz durch Schwerkraft oben auf die Fläschchen, die wiederum stimuliert Klettern in die fliegen ständig neu zu definieren. Im Gegensatz zu anderen Methoden ist die Drehbewegung der TW von Natur aus sanft, die minimiert der Anzahl der zusätzliche Stressoren, die entstehen können und Einfluss auf die Ergebnisse. So ermöglicht die Maschine induzieren Übung in großer Zahl von Fliegen ohne Stress, die Studie zu den Auswirkungen der Übung auf metabolische Gesundheit (Abbildung 2), Altern, Schlaf und viele andere Themen¹¹erlauben wird.

Unsere Methode folgt eine Inverse pyramidale, Intervall Trainingsprotokoll, das vor allem Aspekte der aeroben Intervall-training (AIT) mit einiger Ausdauer umfasst körperliches Training. Das standard-AIT-Regime wird in diesem Protokoll, erhöhen Sie die Dauer der einzelnen Intervallen über einen Zeitraum von fünf Tagen, Ausdauer zu fördern verändert. AIT ist besonders hilfreich bei der Verhinderung von MetS im Vergleich zu anderen Interventionsmethoden und war wirksamer bei der Umkehr metabolisches Syndrom gemeinsame Risikofaktoren als kontinuierliche moderate Bewegung^19,20. Ein Nachteil der TW im Verhältnis zu der Power Tower ist jedoch, dass fliegen schneller gewöhnen, um die Drehbewegung, so Variation der angeborenen Neigung zu unter die fliegen gewöhnen kann die Interpretation der die Vorteile der Übung erschweren. ¹¹ eine elegante Lösung für diese Einschränkung ist durch Watanabe und Rätsel¹⁵ und ihre ergänzenden Artikel²¹beschrieben.

Protocol

1. TreadWheel Setup und Betrieb Hinweis: Siehe ergänzende Abbildung1 für Schaltpläne auf TW Maschinenbau ausüben. Die erforderlichen Teile sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Die Phrasen “TW”, “TreadWheel”, “Trainingsgerät” und “Maschine” werden im gesamten Protokoll synonym verwendet. Kalibrieren, motor mit Ein-/Ausschalter, so dass eine vollständige Rotationsdauer 15 s (4 u/min). Drehzahl der Maschine vor fliegen Fläschchen in gesicherten Schellen befestigt, rotierende Arme zu kalibrieren. Passen Sie Geschwindigkeit mit standard Stoppuhr und einem unbeweglichen Objekt vorübergehend an der Maschine, wie ein kleiner Pinsel mit Klebeband an der Motorabdeckung mit dem Pinsel das Berühren eines rotierenden Klammern befestigt. Zeit die Anzahl der Umdrehungen in einer Minute mit dem unbeweglichen Objekt als Bezugspunkt und passen Sie die Geschwindigkeit um einen 15 s Rotationsdauer (4 u/min) zu erreichen. 2. fliegen Sie Erfassung und Pflege Hinweis: Alle fliegen sind in einem 25 ° C Inkubator mit 50 % Luftfeuchtigkeit und ein 12 h Hell/Dunkel-Zyklus zwischen Benchtop Manipulationen beschrieben gepflegt. Fliegen sind eine standard Maismehl-Melasse-Lab-Diät gefüttert, sofern nicht anders angegeben. Jeder Genotyp mit Apfelsaft Agarplatten Verlegung Kammern vorbereiten, ein Tropfen der Hefe paste pro Platte und 6 Unzen Plastikflaschen sammeln Eier, die schlüpfen Larven. Vorbereiten Apfelsaft Agarplatten, 35 x 10 mm Petrischalen ¾ voll zu füllen, mit 3 % Agar in gekauften Apfelsaft aufgelöst. Erstarrte Platten bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahren. Kombinieren Sie in einem konischen 50 mL Zentrifugenröhrchen gekauften Trockenhefe mit destilliertem Wasser im Verhältnis von 2 mL Wasser für jedes Gramm Hefe. Mix-Hefe mit Wasser zu einer Paste mit der Konsistenz Ketchup mit einem Glas rühren Rute zu schaffen. Passen Sie Hefe und Wasser Proportionen an, wie notwendig, um die gewünschte Konsistenz zu erreichen. Hefe-Paste im Kühlschrank zwischen den Anwendungen zu speichern. Die Kappe Rohr locker, um de-Begasung ermöglichen. Mit einer spitzen Nadel oder Messer um kleine Löcher in die 6 Unzen Stanzen Quadrat unten Flaschen (Polypropylen) als Lüftungsöffnungen für die Verlegung Kammern. Tupfen Sie eine kleine Stelle Hefe Paste (~ 3 mm im Durchmesser) auf jede Apfelsaft Agar-Platte. Fliegen des gewünschten Genotyps in 6 Unzen Flasche und GAP-Flasche mit der Apfelsaft Agar-Platte zu platzieren. Befestigen Sie die Platte in die Flasche mit Gummibändern. Umkehren Sie, und legen Sie in einem Inkubator ermöglicht Erwachsenen, Eier zu legen. Apfelsaft Agarplatten auf eine Verlegung Kammer zweimal täglich (morgens und abends) zu ändern. Urlaub verwendet Platten in den Inkubator für eine weitere 12-24 h erlauben das erste instar Larven schlüpfen. Sammle zuerst instar Larven mit einem dünnen Pinsel oder Sammlung Pick (flexible dünnen Nadel an einem Griff befestigt). Platz 50 zuerst instar Larven von einem bestimmten Genotyp auf ein Lebensmittel Durchstechflasche von der Art der gewünschten experimentelle Küche entwickeln und komplette Metamorphose im Inkubator (Abb. 2A) untergebracht. Sammeln Sie Erwachsene für Übung Behandlung (Abb. 2A). Bei der Verpuppung sammeln Sie Puppen mit einem kleinen, feuchten Pinsel zu und in leeren Fläschchen vor bewegungsapparate zu verhindern, dass fliegen die Larven Nahrung ausgesetzt. Übertragen Sie fliegen auf Essen Durchstechflaschen mit standard-Lab-Diät , wie sie Eclose. Ein bis fünf Tage nach der bewegungsapparate, separate fliegen aufgrund des Geschlechts. Designierte Hälfte der gesammelten Erwachsenen zu den experimentellen und Kontrollgruppen. Pflegen Sie fliegen in Fläschchen mit standard-Lab-Diät bei einer Konzentration von 50 fliegen pro Fläschchen. Übertragen Sie Erwachsene auf frische Lebensmittel Fläschchen alle zwei Tage stecken zu bleiben während der Übung verhindern. Das neue Essen fügen Sie mehrere Körner von ergänzenden live Hefe unmittelbar vor der Einführung der fliegen hinzu.Hinweis: Es ist, zwar möglich, Fliegen ohne live Hefe Ergänzung zu pflegen haben wir festgestellt, dass die Erwachsenen fliegen am besten mit Ergänzung durchführen. Live Hefe-Supplementierung ist eine Variable, die die Forscher experimentelle Ziele angepasst werden könnte. 3. Übung Protokoll Am ersten Tag der Übung (Tag1) Stecker schieben Fläschchen um 1 cm Platz im Kontrollfläschchen und 6 cm Platz zwischen dem Essen und den Stecker in Übung Fläschchen (Abbildung 1) zu verlassen.Hinweis: Kontrollfläschchen werden nur wenig Platz haben für fliegen, während auf dem Heimtrainer zu bewegen und so fliegen rastet in viel weniger Bewegung als in Übung Fläschchen. Fläschchen in die Klammern und geben Sie dann die fliegen 10 min an der Maschine (Abbildung 1B) zu akklimatisieren.Hinweis: Eine alternative Steuerung soll der ungeübten fliegen auf die Benchtop angrenzend an das Trainingsgerät mit 6 cm Platz (in der Phiole) pflegen, um normal bewegen. Ähnliche Ergebnisse im Vergleich zu “1 cm auf TreadWheel” und die “6 cm auf Benchtop” Steuerelemente wurden11gefunden. Sowohl die Kontrolle zu behandeln und Übung fliegt in Rotation auf der Maschine bei konstanter Raumtemperatur an 5 aufeinander folgenden Tagen pro Woche mit wechselnden Anfälle von Rotation und Rest (Abbildung 1D).Hinweis: Eine Konstante Temperatur ist erforderlich, um die verwirrende Auswirkungen der Temperatur auf Aktivität. Legen Sie für Temperatur Manipulation Studien die TW in einer brutmaschine Temperatur Behandlungen während des Übung Trainings ändern. Laufen Sie die Maschine für vier 15 min Kämpfe der Übung am 1. Tag. Diese Kämpfe mit 5 min Ruhepausen abwechseln. Jeweils an den folgenden Tagen, 5 min Übung Hinzufügen einer der bereits vorhandenen Übung Kämpfe. Beispielsweise am Tag2 den ersten Übung Kampf 20 min lang zu machen, aber ans Ende der Kämpfe in 15 min lang zu erhalten. Am 3. Tag fliegt Übung für 20 min während der ersten beiden Kämpfe und 15 min für die folgenden zwei Kämpfe. Am 4. Tag verwenden Sie 20 min Übung Kämpfe für alle außer dem letzten Kampf, der nur 15 min lang sein sollte. Am Tag 5 halten Sie alle Übung Kämpfe 20 min lang.Hinweis: Während der Ruhezeiten, sollte die Fläschchen mit dem Fliegen sicher eingespannt auf der TW bleiben. Die Ausrichtung des Vials in diesen Zeiträumen ist nicht relevant, weil die Gravitationskraft erfahren durch alle fliegen aus der gleichen Richtung kommen wird. Nach Abschluss der Übung-Behandlung für einen bestimmten Tag, die Lebensmittel Durchstechflasche Stecker in ihre normale Position zurück und fliegen zu ihren Inkubatoren erst am nächsten Tag zurück. Nach Abschluss der vollständigen Übung Regime zu betäuben fliegen Fliegen mit Standard-CO2 Anästhesie Methoden. Dann fliegt Transfer neuer Lebensmittel-Fläschchen oder Mikrozentrifugenröhrchen zur Beurteilung der phänotypischen Eigenschaften von Interesse.Hinweis: Beispiel Phänotypen enthalten Klettern Fähigkeit (Lebensmittel Durchstechflasche), Triglyceride Lagerung (Microcentrifuge Schlauch) oder gen-Expression (Microcentrifuge Schlauch). Das Protokoll kann hier mit Proben entsprechend gespeichert, je nach den Bewertungen durchgeführt werden angehalten werden. Assays mit lebenden fliegen müssen umgehend in Übereinstimmung mit den Zielen des phänotypischen Tests durchgeführt werden. 4. Bewertung Klettern Nach einem Ruhetag nach Abschluss der Übung Protokoll, einen Testflug allgemeine Steigleistung mit einer schnellen iterative negative Geotaxis (RING)-wie negative Geotaxis Klettern assay22. Platzieren Sie Gruppen von 10 fliegen in leeren Fläschchen mit CO2 Anästhesie (oder direkt von Essen Fläschchen klopfen, wenn bereits sortiert) und seal mit Paraffin-Film, die fliegen an der Flucht zu verhindern. Geben Sie die fliegen mindestens 10 min, um die neuen Fläschchen zu gewöhnen. Damit Fläschchen nicht umkippen, Band ~ 5 cm Durchmesser Cardstock Kreis auf den Boden des Fläschchen extra Fläche bieten.Hinweis: Fläschchen Stecker sollte nicht verwendet weil sie Bestandteil der Durchstechflasche zur Bestimmung der Höhe behindern kletterte. Legen Sie Fläschchen 20 cm vor einem 1 x 1 cm-Raster in Vollansicht einer angebrachten, stationäre Kamera mit einem integrierten Timer (ein Smartphone mit einem Timer Kamera-Anwendung funktioniert gut). Tippen Sie Fläschchen sanft auf der Zähler dreimal klopfen alle fliegen bis Ende des Röhrchens. Nach dem Tippen auf das Fläschchen nach unten zum dritten Mal, sofort die 4 s-Kamera-Timer um ein Bild, um die Höhe stieg um jede Fliege bestimmen zu erfassen.Hinweis: Tippen auf eine konsequente Intensität und von der gleichen Forscher in jeder Kontrolle ausüben Kontrast, Variation in die fliegen Antworten durch Antippen zu minimieren erfolgt. Wiederholen Sie Schritt 4.1.3 zweimal, mit mindestens 1 min Pause zwischen den Studien, um insgesamt drei Versuche pro Fläschchen zu produzieren. Um zu erhalten die fliegen für weitere Analysen unmittelbar nach Fertigstellung der kletternde-Test, Blitz einfrieren die fliegen durch Untertauchen in flüssigem Stickstoff. Verwenden Sie einen flachen, offenen Dewar-Flasche bis zu einer Tiefe von ca. 5 cm mit flüssigem Stickstoff gefüllt. Übertragen Sie fliegen auf kleine Mikrozentrifugenröhrchen mit CO2 Anästhesie und dann Rohre in die Dewar-Flasche mit flüssigem Stickstoff gefüllt. Alternativ, wenn zukünftige Analysen Vermeidung von CO2benötigen, Snap Einfrieren die fliegen direkt in ihre Klettern Fläschchen durch leichtes Klopfen fliegen am unteren Rand ihrer Fläschchen, während unten in flüssigen Stickstoff getaucht ist, und übertragen Sie dann die gefrorenen fliegen zu Mikrozentrifugenröhrchen mit Pinzette.Hinweis: Flüssigstickstoff ist Kryo und sollte nur mit schützende Ausrüstung und Raum Belüftung verwendet werden. Prozess-Bilder mit den ImageJ23 Mehrpunkt-Auswahl-Werkzeug. Öffnen Sie ein Bild zur Bearbeitung innerhalb von ImageJ. Maßstab 1 cm Raster Hintergrundpapier zur Berechnung der Entfernung stieg um jede einzelne Fliege anhand festgelegt. Verwenden Sie “Line Tool” aus der Symbolleiste zu Spur einer Seite aus einem 1 cm2 Quadrat aus dem Hintergrund Raster Papier. Klicken Sie auf die Registerkarte “Analyze” und wählen Sie “Set”. Legen Sie den “bekannt-Abstand”, wie “1.00” und “Längeneinheit” als “cm”, stellen Sie sicher, dass “Global” deaktiviert ist, und klicken Sie auf “OK”. Wählen Sie das “Multi-Point-Auswahl” Symbol in der Symbolleiste und auf dem Boden des Röhrchens in das Bild hineinzoomen. Legen Sie den ersten Punkt als ganz unten der Durchstechflasche durch Anklicken der unterste Teil des Röhrchens. Klicken Sie auf die Mitte jeder Fliege in der Durchstechflasche zu als Datenpunkte markieren. Beachten Sie, dass es gibt insgesamt 11 Punkte pro Fläschchen, eine Kennzeichnung der Unterseite der Flasche und eine für jede Fliege. Klicken Sie auf die Registerkarte “Analyze” und wählen Sie “Maßnahme”, eine Tabelle der Messwerte zu generieren. Speichern Sie Tabelle als Csv-Datei. Öffnen Sie die Csv-Datei in einem Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen Sie die genaue Entfernung stieg um jede Fliege durch Subtraktion der y-Werte der Punkte 2 bis 11 aus Punkt 1 in der Tabelle der Messwerte. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1 bis 4.3.6 für jedes Bild. 5. Triglycerid-Lagerung-Assay Hinweis: Proben, Normen, Glycerin Standardlösung und Triglycerol Arbeitslösung verwendet während des Tests sollten für die Dauer des Protokolls auf Eis gehalten werden und sollte im Kühlschrank bei Nichtgebrauch gespeichert werden. Bereiten Sie Standards mit Glycerin Standardlösung vor. Die leere (B) zu machen, indem Sie 1.000 µL Homogenisierung Puffer zu einem Microcentrifuge Schlauch mit der Bezeichnung B. Machen Sie Standard 1 (S1), 2,5 mg/mL pro Bohrloch, durch Zugabe von 1.000 µL der Standardlösung Glycerin zu einem Microcentrifuge Schlauch mit der Bezeichnung S1. Machen Sie Standard 2 (S2), 1,25 mg/mL pro Bohrloch, durch Zugabe von 500 µL Glycerin-Standardlösung, 500 µL DiH2O in einem Microcentrifuge Schlauch mit der Bezeichnung S2. Standard 3 (S3), 0,625 mg/mL pro Bohrloch, indem Sie 750 µL DiH2O in einem Microcentrifuge Schlauch mit der Bezeichnung S3 250 µL der Standardlösung Glycerin hinzufügen zu machen. Standard 4 (S4), 0,3125 mg/mL pro Bohrloch, indem Sie 875 µL des diH20 in einem Microcentrifuge Schlauch mit der Bezeichnung S4 125 µL der Standardlösung Glycerin hinzufügen zu machen. Triglycerol funktionierende Lösung aus dem Serum Triglycerid Entschlossenheit Kit vorbereiten. Das kostenlose Glycerin-Reagenz aus dem Kit 40 mL der DiH2O hinzu und mischen durch Umdrehen der Flasche. 10 mL DiH2O der Triglycerid-Lösung von Kit und mischen durch Umdrehen der Flasche. Glycerin-Reagenz und Triglycerid-Lösung kombinieren und mischen durch umdrehen um die Arbeitslösung Triglycerol vorzubereiten.Hinweis: Die Triglycerol funktionierende Lösung eignet sich für 60 Tage und kann vier 96-Well-Platte-Assays pro Kit unter Verwendung des Protokolls unten vervollständigen. Die Volumes verwendet werden aus dem offiziellen Serum Triglycerid Entschlossenheit-Kit für den Einsatz im Format 96-Well-Platte proportional verkleinert. Überprüfen Sie Blank und Standards durch sorgfältig pipettieren 5 µL jeder Norm in eine 96-Well-Wohnung die Talsohle, klare Mikrotestplatte in dreifacher Ausfertigung (oder vervierfacht für den Rohling). Hinzu kommt auch jeweils einen Standard genau 125 µL Triglycerol arbeiten Lösung. Lassen Sie Lösungen für 30 min. einwirken. Legen Sie eine 96-Well-Platte in einem Spektrophotometer und lesen die Extinktion bei 540 nm. Verwenden Sie die Extinktion Messungen eine Standardkurve erstellen und überprüfen die Richtigkeit der Standards durch die Auswertung des R-2 -Wert. Wenn die R-2 für die Standards 0,98 unterschreitet, bereiten Sie erneut die Standards genauer. Beginnen Tag1 des Assays für Triglyceride Lagerung14 mit Mikrozentrifugenröhrchen, enthält 10 gefroren fliegt jeder.Hinweis: Eine Wiederholung oder mehrkanalige-Pipette sollte nie in diesem Schritt verwendet werden, da die Mengen an jedes Reagens verwendet im Test sehr genau und konsequent, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten sein müssen. Nach unserer Erfahrung müssen wiederholende und mehrkanalige-Pipetten nicht diesen Grad an Genauigkeit und Konsistenz. Jeder Aliquote aus einem einzigen Kanal-Pipette kann visuell bestätigt werden, indem der Experimentator für Qualitätskontrolle und jeder Kanal Pipette-spezifische Vorurteile werden durch alle Proben in gleichem Maße erlebt werden. Bereiten Sie eine 200 mL Brühe der Homogenisierung Puffer durch die Kombination 0,272 g KH2PO4, 400 µL 0,5 M EDTA und 199,6 mL DiH2O in einer Glasflasche. Genau 100 µL der Homogenisierung Puffer hinzu kommt jeweils die 40 Mikrozentrifugenröhrchen mit 10 Erwachsenen nach Klettern Assay eingefroren. Anschließend Zentrifugieren Sie Proben für 30 s bei 18.000 g. Grind fliegt mit einer motorisierten Schleifmaschine und Stößel (oder eine andere Form der Gewebe Homogenisierung) um eine milchige Lösung vorzubereiten. Sicherstellen Sie, dass für jede Probe eine frische Stößel verwendet wird. Anschließend Zentrifugieren Sie Proben für 2 min bei 18.000 g. Nur die Top 75 µL der überstehenden Flüssigkeit aus jeder Tube in neue Mikrozentrifugenröhrchen Pipette. Stellen Sie sicher, dass keine fliegen Bits aus dem Pellet über übertragen werden. Legen Sie neue Röhren im Kühlschrank über Nacht. Beginnen Sie Tag 2 des Protokolls Triglycerid durch das Entfernen von Tag1 Proben aus dem Kühlschrank.Hinweis: Schritt 5.5 kann am selben Tag als 5.4 durchgeführt werden, aber wir haben festgestellt, dass das Signal für die Triglycerid-Konzentration nach einer Nacht im Kühlschrank robuster sein. Allerdings sollte die Zeit zwischen Schritte 5.4 und 5.5 36 h nicht überschreiten. (Optional) Wirbel der ersten Röhre mit überstehenden Flüssigkeit für 10 s und Pipette 5 µL zu einem sauberen Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 95 µL 0,15 M NaCl in den neuen Microcentrifuge Schlauch. Speichern Sie diese Teilproben in den Gefrierschrank-20 ° C für einen späteren Protein-Assay, falls gewünscht.Hinweis: Diese Beispiele überstand mit der zusätzlichen NaCl-Lösung lässt sich Proteingehalt des Forschers bevorzugte Assay mit bestimmen. Wir verwenden die Bradford Methode24. Der Proteingehalt ist eine Möglichkeit, das Maß der Triglycerid-Inhalte standardisieren aber der Forscher sollte auch vorsichtig bei der Interpretation dieser Verhältnisse seit Übung und Diät kann auch Auswirkungen auf Protein-Lagerung. Für die ursprüngliche überstand Fläschchen repliziert Wirbel das erste Rohr mit überstehenden Flüssigkeit für 10 s, dann Pipette 5 µL in zwei separaten Brunnen von einer 96-Well-Mikrotestplatte technische produzieren. Achten Sie darauf, Hinweis, welche Brunnen für jede Probe verwendet werden. Wiederholen Sie diesen Schritt für den 39 anderen Rohren. Pipette genau 5 µL des Rohlings in vier Vertiefungen der Mikrotestplatte, und für die übrigen Brunnen pipette genau 5 µL jeder Norm in dreifacher Ausfertigung. Jede Vertiefung genau 125 µL Triglycerol funktionierende Lösung hinzu, und lassen Sie Lösung 30 min. einwirken. Die 96-Well-Platte in einem Spektrophotometer und lesen die Extinktion bei 540 nm. Extinktion Werte in Konzentration (mg/mL) anhand der Standardkurve berechnet aus den Standards zu konvertieren.

Representative Results

Wir interessieren uns insbesondere bei der Ermittlung der Faktoren, die zu den insgesamt metabolische Gesundheit des Individuums. Zuvor wurde festgestellt, dass Interaktion Genotyp durch Ernährung wesentlich zur Ebene Bevölkerungsanstieg in metabolischen Eigenschaften14beitragen. Dies bedeutet, dass jeder Genotyp auf ökologische Unterschiede in einer einzigartigen und komplexen Weise reagiert. Um unsere Arbeit auf Genotyp-Umgebung-Effekte, um körperliche Bewegung gehören zu erweitern, haben wir die TreadWheel entwickelt die vermag Aufdeckung zahlreicher Genotypen zu aeroben Intervall-training (AIT) in gewissem Sinne Hochdurchsatz. Um festzustellen, ob die Übung auf der TW metabolische Eigenschaften beeinflusst, wir Maßen Triglycerid Lagerung in Oregon-R (OreR) und y1w1 fliegt, gemeinsame Wildtyp fliegen (Abbildung 2B – C), und normalisiert diese Werte gegen der Flies Proteinkonzentration, wie ursprünglich in Mendez Et Al. berichtet 11. wir analysierten die Daten von multivariate Varianzanalyse (MANOVA) Buchhaltung für Genotyp, Geschlecht, Behandlung (und deren Wechselwirkungen) ausüben, und experimentelle Block Effekte wie Zeit repliziert und Essen Fläschchen und fanden, dass es eine signifikante Genotyp durch Übung Interaktion (p = 0.0017) Triglyceride Lagerung beeinflussen. Gab es eine erhebliche sexuelle dimorphen Wirkung zwischen Männchen und Weibchen mit Männchen mehr Triglyceride als Frauen (p < 0,0001) zu speichern. Wir sahen, dass bei Frauen ausgeübte fliegen deutlich Triglycerid-Spiegel als ihre ungeübten Kollegen hatte (Abbildung 2B, p < 0,0001). Bei den Männern während der Rückgang der Triglycerid-Lagerung in Oregon-R beobachtet ausgeübt fliegen (im Vergleich zu Kontrollen) war statistisch nicht signifikant, ein signifikanter Unterschied im Triglycerid-Speicher zwischen den beiden separaten Linien (Abbildung beobachtet wurde 2C, p < 0,0001). Beachten Sie, dass die Standardisierung der Triglycerid-Konzentration gegen die Proteinkonzentration Einblick bietet auf insgesamt fliegen Körper Zusammensetzung Verhältnisse, Vergleich der direkten Triglyceride oder Protein-Konzentration unter verschiedenen Gruppen von fliegen auch geben können spezifische Informationen über die Wirkung der Übung auf diese Phänotypen individuell. Da Variablen wie Erwachsene Übung, Sex, und Genotyp werden gezeigt, um Triglyceride Lagerung beeinflussen, wurde davon ausgegangen, dass diese Faktoren auch Auswirkungen auf andere Phänotypen und mit Diät interagieren. Wir hoben Larven von einer repräsentativen Wildtyp Drosophila genetische Bedienfeld “Referenz” Zeile (DGRP 153)25 auf einem hohen Fett- oder normale Ernährung und induzierte Bewegung in Erwachsenen fliegen für eine Woche (Abb. 2A). Anschließend führten wir einen Ringartige negative Geotaxis Assay Steigfähigkeit zu messen. Das Klettern Assay verwendet unterscheidet sich von einem standard RING-Assay; anstelle von einem RING-Apparat dienten Fläschchen mit Paraffin-Film über die Öffnungen zu Stubenfliegen während des Tests. Andere Aspekte des ursprünglichen RING Tests, wie z. B. abwechselnd durch Tippen auf die fliegen auf den Boden der Flasche und der Aufnahme wurden einbehaltene22. Alle Behandlungen wurden drei Mal mit einem Minimum an 59 einzelne fliegen pro Zeit replizieren und Behandlung wiederholt. Daten wurden analysiert von MANOVA Bilanzierung Diät, Genotyp, Geschlecht, Behandlung (und ihre Interaktionen), sowie experimentelle Block Auswirkungen von Zeit replizieren, Assay Fläschchen und Fläschchen Assay replizieren. Wir fanden, dass die ausgeübten Weibchen deutlich höher geklettert (p < 0,005) Wenn auf der fettreichen Diät als alle anderen weiblichen Behandlungen (Abbildung 2D) aufgezogen. Für die Männchen wurde gesehen, dass Übung nur Klettern verbessert wenn Männer wurden auf die normale Ernährung, und diejenigen auf der fettreichen Diät zeigte keine signifikante Veränderung (Abb. 2E) erhoben. Wir fanden auch sexuell dimorphen spürbar (p < 0,0001) beim Klettern bei Männern höher als bei Frauen. Das überraschende Ergebnis einen Rückgang der Steigleistung folgende Übung für Frauen aus der DGRP 153-Linie (Abb. 2D) für Frauen, die eine normale Ernährung konsumieren (p < 0,0001) ist ein Beispiel, wie diese Art von Übung möglicherweise kein einheitlich positive Intervention für alle Genotypen und andere Umweltfaktoren abhängig sein könnte. In Mendez Et al. 11, Weibchen aus vier anderen genetischen Linien getestet für ihre kletterperformance nach haben an einem ganz normalen angehoben worden Diät alle zeigte verbesserte Steigfähigkeit mit Übung Training. Dies deutet darauf hin, dass die Reaktion beobachtet in DGRP 153 genotypspezifischen und keine allgemeine Eigenschaft der TW-Übung-Behandlung. Die Variabilität der Reaktion über Sex, Ernährung und Behandlung Übungsgruppen gibt an, dass signifikante Sex durch Diät durch Übung Wechselwirkungen, die die Steigfähigkeit der Linie betrifft (p < 0,0001). Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass die Wirkung der Übung auf einem Erwachsenen fliegen metabolische Gesundheit eine Funktion seiner Sex, Genotyp und Larven Ernährung sein kann. Der phänotypische Variation beobachtet als Reaktion auf Genotyp, Environment-Variablen (z.B., Ernährung und Bewegung), und Sex ist auch beobachtet worden in anderen Studien11,12,14,15. TW und Drosophila kann somit eine wirkungsvolle Strategie, die genetischen und umweltbedingten Faktoren Formen metabolische Gesundheit aufzuklären. Abbildung 1 : The TreadWheel Heimtrainer. (A) die Maschine hält 48 Fläschchen und verfügt über eine einstellbare Geschwindigkeit-Funktion. Hier wurden Experimente mit 4 u/min durchgeführt. (B) einzelne Lebensmittel Ampullen mit den experimentellen fliegen wurden Klammern befestigt, eine rotierende Achse eingeschnappt. (C) der Abstand zwischen Fläschchen Stecker und das Essen war 6 cm für Übung Vials und 1 cm für Kontrollfläschchen. Die Ampullen wurden dann auf dem Computer für Übung platziert. (D) die 5-tägige inverse Pyramide Übung Regime wurde verwendet, um fliegen zu trainieren. Jeden Tag eine weitere fünf Minuten wurde hinzugefügt, um einer der Übung Kämpfe zur Rampe herauf Trainingsintensität schrittweise, die Ausdauer-Modelle, Intervall-Training. Diese Zahl wurde von Mendez Et Al. modifiziert 11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Optische Methoden und repräsentative Ergebnisse. (A) Methoden zur Prüfung von Larven Diät und Erwachsenen Übung Wechselwirkungen. Larven wurden aufgezogen auf hohen Fett oder normalen Labor Ernährung und auf normale Nahrung auf bewegungsapparate umgestellt. Erwachsene fliegen wurden getrennt nach Geschlecht, in experimentellen Gruppen platziert und an fünf aufeinander folgenden Tagen ausgeübt. Danach eine Ringartige negative Geotaxis Klettern Test wurde durchgeführt, und fliegen für Triglycerid Messungen eingefroren wurden. Repräsentative Triglycerid Daten erscheinen zwei genetische Linien, Oregon R und y1w1 für (B) Weibchen und Männchen (C). Alle fliegen waren auf einer normalen Ernährung aufgezogen und im Erwachsenenalter ausgeübt. Ebenen mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich deutlich (p < 0,05) mit einer post-Hoc -Student t-test. Diese Zahl enthält eine Teilmenge der Daten in Mendez Et Al. berichtet 11. repräsentative Klettern Daten für Linie DGRP 153 für (D) Weibchen und Männchen (E) angezeigt. Jeder Punkt entspricht der gemittelte Steigleistung von 232 oder mehr Personen über drei unabhängige Zeitpunkten. Fehlerbalken zeigen einen Standardfehler. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Ergänzende Abbildung1: eine detaillierte schematische Darstellung der TreadWheel. (A) Schema der dual Fläschchen Klemme Struktur Fläschchen an der Maschine befestigt. (B) Innenansicht der rotatorischen Antrieb der Maschine. (C) Parallelprojektion der Vorderseite der Maschine. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Zusätzlicher Code-Datei: TreadWheel.skp Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Discussion

Die Übung Protokoll hier detailliert nachweislich erfolgreich sanfte Bewegung in Drosophila stimulieren und Ausdauertraining in einem kontrollierten Labor¹¹simulieren einsetzbar. Es sei darauf hingewiesen, dass bei der Entwicklung von zunächst des TreadWheel Konzepts wir Handelsprodukte, die geändert werden könnte betrachtet, um in ähnlicher Weise durchzuführen (z.B. einem Labor Drehspieß). Jedoch lehnten wir letztlich dieser Ansatz eine Custom-Built Design zu wählen, weil der kommerziellen Geräten nicht ausreichend niedrigen Drehzahl (4 u/min haben) und ausreichend Fläschchen Fähigkeit für Hochdurchsatz-Probe Generation fehlte.

Das TW-Protokoll selbst kann eingestellt werden, um eine Vielzahl von Forschungsthemen umfassen. Zum Beispiel kann Anpassung der Häufigkeit und Dauer der Übung Regime die fliegen die Intensitäten der Arbeit-outs verändern, die sie erhalten. Durch die Erweiterung des Protokolls, die länger als eine Woche oder für andere Altersgruppen, wäre es möglich, die Auswirkungen der Übung über das Altern und verschiedene altersbedingte Krankheiten zu studieren. Es wird empfohlen, wenn ein längere Übung Ansatz umgesetzt wird, dann mindestens einen Ruhetag pro Woche hinzugefügt werden soll, um Erholung zu ermöglichen. Leistung und Verbesserung zeigte sich in Regimen größer sein, die ein Erholungstag als diese Regelungen enthalten, die aufeinander folgenden täglichen Übung¹²verwendet. Auch würden wir warnen vor Verlängerung Übung Kampf Längen letzten 30 min da Gewöhnung an der Drehbewegung auftreten kann, nachdem längere kontinuierliche^{11 Übung}. Wir haben auch genetische Variationen in fliegen Motivation weiterhin ihre Aktivität auf der TW-¹¹beobachtet. So wird eine längere Kämpfe gewünscht, halte Überwachungsstufen die fliegen Aktivität, wie von Watanabe und Rätsel^15,21 , beschreibt deren Änderung des Begriffs TW vorgestellt. Andere Faktoren, die variiert werden konnte sind Temperatur und Schlaf-Wach-Muster, die gezeigt werden, um auch fliegen Bewegungen^26,27beeinflussen.

Es gibt eine Vielzahl von verfügbaren Analysen während und nach Abschluss der Protokoll zur Bekämpfung der Auswirkungen der Übung der physiologischen, Verhaltens- und molekularen Ebene, als auch das Potenzial, epigenetische Effekte der Übung zu entwirren. Weitere metabolische Assays (z. B. Glukose, Glykogen und Eiweiß), Herzleistung und entzündliche Reaktion Maßnahmen können verwendet werden, um den Effekt Bewegung weiter zu erforschen hat auf Fliege Physiologie und Körper Zusammensetzung^{12,14 ,24,28}. Verschiedene Verhaltensänderungen zugeordnet Übung Induktion, wie Veränderungen in der Ernährung, Verhalten, lokomotorische Aktivität und Schlaf, können auch mit Tools wie das CAFE Assay²⁹ oder Activity monitoring-Geräte^{12,15 gemessen werden ,30}. Veränderungen in der Genexpression und Zellatmung zugeschrieben zur Ausübung können auch mit Methoden wie qRT-PCR¹¹ und respirometrie³¹quantifiziert werden. Zu guter Letzt haben Drosophila wertvolle genetische Ressourcen zur Verfügung, wie Drosophila Genetik Bedienfeld “Referenz” 2 und Drosophila synthetische Bevölkerung Ressource, die Forscher die Plattform ausführen zur Verfügung quantitative genetische Studien^25,32. Diese Tools ermöglichen Zuordnung Experimente, wie z. B. Genomweite Assoziationsstudien und Quantitative Trait Loci Mapping, um Kandidaten Loci verbunden mit Bewegung und Ernährung zu identifizieren.

Studium mit der TreadWheel gezeigt, dass durchschnittlich Übung Körpergewicht, total Triglycerid Lagerung und Glykogen, gleichzeitiger Erhöhung der Eiweißgehalt und Klettern Leistung¹¹verringert. Darüber hinaus gab es Variable Antworten über Geschlechter und Genotypen für Körpergewicht, sowie Triglyceride, Protein, Glykogen, Glukose und Aktivität Ebenen^11,15ausüben. Während die Variabilität der Reaktion auf Bewegung und Ernährung über Genotypen und Sex möglicherweise schwierig zu interpretieren, und manchmal, eingängig, es die Quellen der echten biologischen Variation in natürlichen Populationen beobachtet spiegelt. Wir bemühen uns, die Vielfalt der zugrunde liegenden Faktoren für die hohe Rate der MetS verstehen, werden Werkzeuge, die zu erleichtern, entwirrt die relative Bedeutung der verschiedenen Einflussfaktoren durch das Testen dieser Faktors in Modellorganismen zentraler Erfolgsfaktor personalisierte Prävention und Behandlung Interventionen zu entwickeln. Um die Effektivität der Übung umfassend zu bewerten, muss jedes dieser Faktoren und wie sie interagieren betrachtet werden bei Durchführung von Experimenten und Formulierung von Schlussfolgerungen.

TW, wie die meisten anderen fliegen Trainingsgeräte ist in seiner Fähigkeit zu fliegen Bewegung quantifizieren begrenzt. Vor kurzem entwickelte Watanabe und Rätsel der rotierenden Bewegung Quantifizierung System (REQS), einen TW-Backbone mit einer Activity monitoring-Einheit (LAM25H) von Drosophila-Monitoring-System Serie^15,21geändert. Wie die TW dieses System nutzt Drehbewegung induzieren sanft Übung während der Verwendung des LAM25H Arms zu verfolgen und zu quantifizieren, Fliege Aktivität, aber es hält eine geringere Anzahl von Fläschchen (32 Fläschchen) als der TW-¹⁵. Hochdurchsatz-Übung Studien Aktivität Quantifizierung nicht erforderlich oder gewünscht, ist ermöglicht die TW für eine größere Anzahl von Proben. Das TW-Design könnte auch aus seiner jetzigen Form, eine größere Anzahl von Fläschchen unterzubringen geändert werden. Dieses System, zusammen mit anderen bestehenden Übung Methoden geholfen um festzustellen, dass Übung nicht nur erreichbar in Drosophila ist , sondern auch untersucht werden, kann um die Wirkung von körperlicher Aktivität auf einer Vielzahl von physiologischen und molekularen Reaktionen ^{ermitteln 11,12,15}. Somit kann die TW als eine bewährte Methode des Verursachens sanfte Bewegung in fliegen, verwendet werden, eine Vielzahl von biologischen Fragestellungen zu untersuchen.

Materials

Materials for TreadWheel Construction:
Heavy Duty Vibration-Damping leveling Mount	McMaster-Carr	60855K71	Quantity: 4
Stainless Steel Ball Bearing	McMaster-Carr	57155K306	Quantity: 8
Plug-in Voltage Transformer (500MA, 120VAC input, 24 VAC output)	McMaster-Carr	70235K16	Quantity: 1
Compact Square-Face DC Gear motor	McMaster-Carr	6409K23	Quantity: 1
Tool Holder (clamps)	McMaster-Carr	1723A22	Quantity: 5 (10x)
12L14 Carbon Steel Tight-Tolerance Rod	McMaster-Carr	5227T24	Quantity: 1
Set Screw Shaft Collar	McMaster-Carr	6432K13	Quantity: 8
Round-Belt Pulley	McMaster-Carr	6284K51	Quantity: 5
Dart Controls – 25 Max RPM, Electric AC DC Motor	McMaster-Carr	13DV 1A	Quantity: 1
Materials for Fly Maintenace and Husbandry
6 oz Square Bottom Bottles (polypropylene)	Genesee Scientific	32-130	Quantity: 1
35x10mm Petri Dishes	VWR	82050-536	Quantity: 1
Narrow Drosophila vials	Genesee Scientific	32-116	Quantity: 1
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	59-114	Quantity: 1
Blowgun, Mini	Genesee Scientific	54-104	Quantity: 1
Materials for RING-like Assay:
ImageJ software	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/	Quantity: 1
1 cM graph paper or drawn grid (at least 20 cM by 30 cM)	various		Quantity: 1
digital camera with timer or smart phone with camera timer app	various		Quantity: 1
Materials for Triglyceride Assay:
Dewar Flask	VWR	14200-960	Quantity: 1
Serum Triglyceride Determination Kit	Sigma Aldrich	TRO100	Quantity: 1
Cordless Pestle Motor	VWR	47747-370	Quantity: 1
Pestles	VWR	47747-358	Quantity: 1