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Genética

TreadWheel: Drosophila melanogaster में धीरे प्रेरित व्यायाम के लिए अंतराल प्रशिक्षण प्रोटोकॉल

Published: June 08, 2018
doi:
10.3791/57788
, , ,
1Department of Biological Sciences,University of Alabama

Summary

TreadWheel घूर्णन गति का उपयोग करता है धीरे ‘ मक्खियों जन्मजात, नकारात्मक geotaxis शोषण से वयस्क Drosophila melanogaster में व्यायाम प्रेरित । यह व्यायाम और कारकों के बीच बातचीत के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जैसे जीनोटाइप, सेक्स, और आहार, और शारीरिक और आणविक परख पर उनके प्रभाव चयापचय स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए ।

Abstract

जटिल चयापचय रोगों की घटना बढ़ी गरमी सेवन और कम गतिविधि के स्तर की जीवन शैली की दिशा में एक व्यापक संक्रमण का एक परिणाम के रूप में वृद्धि हुई है । ये multifactorial रोग आनुवंशिक, पर्यावरणीय, और व्यवहार कारकों के संयोजन से उत्पन्न होते हैं । ऐसा ही एक जटिल रोग मेटाबोलिक सिंड्रोम (मेट्स) है, जो उच्च रक्तचाप, hyperglycemia, और पेट के मोटापे सहित चयापचय संबंधी विकार का एक समूह है । व्यायाम और आहार हस्तक्षेप प्राथमिक उपचार मोटापे और उसके बाद चयापचय रोगों को कम करने के लिए डॉक्टरों द्वारा अनुशंसित कर रहे हैं । व्यायाम हस्तक्षेप, विशेष एरोबिक अंतराल प्रशिक्षण में, टाइप 2 मधुमेह (T2DM), हृदय रोग (सीवीडी), और अन्य स्थितियों के लिए आम जोखिम वाले कारकों में अनुकूल परिवर्तन उत्तेजित करता है । उपचारात्मक प्रभाव व्यायाम का वर्णन सबूत की आमद के साथ चयापचय स्वास्थ्य पर है, एक प्रणाली है कि एक नियंत्रित सेटिंग में मॉडल व्यायाम एक प्रयोगात्मक संदर्भ में व्यायाम के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है की स्थापना । Drosophila melanogaster शारीरिक और आणविक परिवर्तन है कि व्यायाम के हस्तक्षेप से परिणाम की जांच के लिए एक महान उपकरण है । मक्खियों कम उंर और metabolizing पोषक तत्वों के समान तंत्र जब मनुष्यों की तुलना में है । Drosophilaमें व्यायाम प्रेरित करने के लिए, हम TreadWheel, जो मक्खी सहज, नकारात्मक geotaxis प्रवृत्ति धीरे चढ़ाई प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल नामक एक मशीन विकसित की है । यह शोधकर्ताओं आनुवंशिक रूप से विविध मक्खियों के बड़े साथियों पर प्रयोग करने के लिए बेहतर जीनोटाइप द्वारा पर्यावरण चयापचय स्वास्थ्य पर व्यायाम के प्रभाव अंतर्निहित बातचीत को समझने के लिए सक्षम बनाता है ।

Introduction

बचपन और वयस्क मोटापे संस्कृतियों में महामारी बढ़ रही है कि उच्च गरमी आहार उपभोग और समय की विस्तारित अवधि के लिए निष्क्रिय रहते हैं, जो गंभीर दीर्घकालिक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, इंसुलिन प्रतिरोध सहित, जीर्ण सूजन, और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस 1 , 2 , 3 , 4. इन विकारों की व्यापकता गरमी सेवन और व्यय में बढ़ते असंतुलन के कारण वृद्धि के लिए वसा और शर्करा और एक मुख्य रूप से गतिहीन जीवन शैली5के ऊंचा उपभोग के लिए जिंमेदार ठहराया है । तदनुसार, इस ऊर्जा असंतुलन प्रकार के मामलों में वृद्धि के लिए नेतृत्व किया है 2 मधुमेह (T2DM) और हृदय रोग (सीवीडी)5। व्यक्तियों दोनों विकारों अगर वे विकार चयापचय सिंड्रोम (मेट्स), जिसके लक्षण उदर मोटापा और डिसलिपिडेमिया2शामिल है के साथ का निदान किया गया है के विकास के एक उच्च जोखिम पर हैं । मेट्स जीनोटाइप और आहार और व्यायाम6के रूप में विभिंन पर्यावरणीय कारकों, के बीच जटिल बातचीत के आकार का है । इस प्रकार, इस जटिल रोग के अंतर्निहित तंत्र की पूरी समझ हासिल करने के लिए, इन सभी कारकों पर विचार किया जाना चाहिए ।

जब यह मेट्स का मुकाबला करने की बात आती है, डॉक्टरों पहले जीवन शैली में परिवर्तन है कि एक स्वस्थ, अच्छी तरह से संतुलित आहार और शारीरिक गतिविधि2,7,8खाने शामिल दौर से गुजर सलाह देते हैं । के बाद से प्रभावी दवाएं सीमित है और गैस्ट्रिक बाईपास सर्जरी महंगा है और आजीवन चिकित्सा निगरानी की आवश्यकता है, औषधीय और सर्जिकल हस्तक्षेप ही गंभीर मामलों के लिए सिफारिश की है और केवल इन जीवन शैली में परिवर्तन के साथ संयोजन में3 ,7,8. इस तरह के व्यायाम और परहेज़ के रूप में जीवन शैली हस्तक्षेप, जबकि, उत्पादन और लंबे समय तक वजन घटाने के लक्ष्यों को बनाए रखने, चाहे या नहीं इन सुधारात्मक उपायों पूरी तरह से नकारात्मक मेट्स के साथ जुड़े प्रभाव उंनति कर सकते है आगे7अध्ययन की जरूरत है, 8.

माउस मॉडल वर्षों के लिए चयापचय रोगों पर व्यायाम के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, मेट्स पर अनुसंधान उड़ान भरने के लिए व्यायाम की शुरूआत एक अपेक्षाकृत हाल के प्रयास9,10,11,12है । मक्खियों एक नियंत्रित प्रयोगशाला की स्थापना में व्यायाम का अध्ययन करने के लिए एकदम सही वाहन प्रदान करते हैं, क्योंकि वे आसानी से हेरफेर कर रहे हैं, एक छोटी उम्र है, को बनाए रखने के लिए सस्ती कर रहे हैं, और ऊर्जा से संबंधित चयापचय रास्ते अत्यधिक Drosophila के बीच संरक्षित कर रहे हैं और मनुष्य13. D. melanogaster जीनोम अच्छी तरह से विशेषता है, और वहां आनुवंशिकी Drosophila में उपयोग के लिए उपलब्ध है कि विभिंन पादी और जीनोटाइप में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है उपकरण का खजाना है-द्वारा पर्यावरण बातचीत कि संग्राहक सकता है जीव स्वास्थ्य पर व्यायाम का प्रभाव14.

Drosophila व्यायाम के वर्तमान तरीके है मक्खी सहज, नकारात्मक geotaxis प्रवृत्ति, व्यवहार वृत्ति ऊपर की ओर चढ़ने के लिए, उनके बाड़ों के भीतर वयस्कों में चढ़ाई उत्तेजित करने के लिए11,12,15 . बिजली टॉवर, एक विधि मक्खियों में व्यायाम को उत्तेजित करने के लिए, व्यवस्थित मक्खी बाड़ों खड़ी उठाती है और फिर उंहें वापस बूंदें पीठ की सतह के लिए, प्रभावी ढंग से शीशी के नीचे करने के लिए मक्खियों दस्तक, इस प्रकार उनके instinctual नकारात्मक उत्प्रेरण geotaxis 12 , 16. इस मशीन का उपयोग कर आयोजित प्रयोगों से पता चला कि व्यायाम सीवीडी और T2DM सहित कई उम्र से संबंधित रोगों के खिलाफ एक शक्तिशाली सुरक्षात्मक कारक है, और स्वस्थ बुढ़ापे12,17,18 को बढ़ावा देता है . विशेष रूप से, उंहोंने दिखाया है कि व्यायाम मक्खियों में उंर से संबंधित गतिशीलता गिरावट की शुरुआत को कम करने और हृदय के प्रदर्शन और तनाव की प्रतिक्रिया के रूप में कई उंर से संबंधित लक्षण, सुधार कर सकते है17,18। हालांकि, नियंत्रण टॉवर पर रखा कभी नहीं मक्खियों, मशीन का अनुभव उन से अधिक चढ़ाई स्कोर दिखाया, दोहराए बूंदें के बल सुझाव मक्खियों घायल हो सकता है और गतिशीलता12प्रभावित । यह सुझाव है कि व्यायाम है कि कम सशक्त है उत्प्रेरण का एक वैकल्पिक तरीका है और शारीरिक आघात के कारण से बचा जाता है एक उपयोगी, बिजली टॉवर प्रोटोकॉल16के लिए पूरक पद्धति होगी ।

धीरे Drosophila में व्यायाम प्रेरित करने के लिए , हम एक व्यायाम TreadWheel (चित्रा 1) नामक मशीन विकसित कीहै । TreadWheel (इसके बाद के रूप में संक्षिप्त TW के रूप में) घूर्णन गति लगातार मक्खियों की शीशियों, जो, बारी में, मक्खियों में चढ़ने को उत्तेजित करता है के गुरुत्वाकर्षण शीर्ष को फिर से परिभाषित द्वारा ‘ मक्खी सहज, नकारात्मक geotaxis प्रवृत्ति से चलाता है । अंय तरीकों के विपरीत, TW के रोटेशन गति स्वाभाविक कोमल है, जो अतिरिक्त तनाव है कि उत्पंन हो सकती है और परिणाम प्रभाव की संख्या को कम करता है । इस प्रकार, मशीन तनाव उत्प्रेरण के बिना मक्खियों की बड़ी संख्या में व्यायाम प्रेरित करने के लिए साधन प्रदान करता है, जो शोधकर्ताओं चयापचय स्वास्थ्य पर व्यायाम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सक्षम हो जाएगा (चित्रा 2), उम्र बढ़ने, नींद, और कई अन्य विषयों11.

हमारे विधि एक व्युत्क्रम पिरामिड, अंतराल प्रशिक्षण प्रोटोकॉल है, जो बड़े पैमाने पर कुछ धीरज व्यायाम प्रशिक्षण के साथ एरोबिक अंतराल प्रशिक्षण (AIT) के पहलुओं को शामिल निंनानुसार है । मानक AIT शासन इस प्रोटोकॉल में बदल के लिए धीरे से एक पांच दिन की अवधि में एक अंतराल की अवधि को बढ़ाने के लिए धीरज को बढ़ावा देने है । AIT अंय हस्तक्षेप तरीकों के सापेक्ष मेट्स को रोकने में विशेष रूप से उपयोगी है और अधिक लगातार मध्यम व्यायाम19,20से चयापचय है सिंड्रोम आम जोखिम कारकों reversing में प्रभावी था । हालांकि, बिजली टॉवर के सापेक्ष TW की एक नुकसान यह है कि मक्खियों को और अधिक जल्दी से घूर्णन गति के लिए habituate, इस प्रकार habituate को मक्खियों के बीच सहज प्रवृत्ति में भिंनता व्यायाम के लाभों की व्याख्या जटिल कर सकते हैं । 11 इस सीमा के लिए एक सुरुचिपूर्ण समाधान वातानाबे और पहेली15 और उनके पूरक अनुच्छेद21द्वारा वर्णित है ।

Protocol

1. TreadWheel सेटअप और ऑपरेशन नोट: TW व्यायाम मशीन निर्माण पर योजनाबद्ध के लिए पूरक चित्रा 1 देखें । आवश्यक भागों सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं । वाक्यांश “TW”, “TreadWheel”, “व्यायाम मशीन”, और “मशीन” interchangeably प्रोटोकॉल भर में उपयोग किया जाता है । इस तरह कि एक पूर्ण रोटेशन अवधि 15 एस (4 rpm) है पावर स्विच का उपयोग कर मोटर जांचना । घूर्णन हथियारों से जुड़ी सुरक्षित clamps में मक्खी शीशियों रखने से पहले मशीन रोटेशन गति जांचना । एक मानक स्टॉपवॉच का उपयोग कर गति को समायोजित करें और अस्थायी रूप से मशीन से जुड़ी एक छोटी सी पेंट ब्रश के साथ मोटर कवर करने के लिए टेप बस घूर्णन कोष्ठक में से एक को छूने के रूप में इस तरह, । समय एक संदर्भ बिंदु के रूप में और एक 15 एस रोटेशन अवधि (4 rpm) को प्राप्त करने के लिए गति को समायोजित करने के लिए एक मिनट में रोटेशन की संख्या का उपयोग कर । 2. फ्लाई संग्रह और रखरखाव नोट: सभी मक्खियों के साथ एक 25 डिग्री सेल्सियस मशीन में बनाए रखा ५०% आर्द्रता और benchtop जोड़तोड़ नीचे वर्णित के बीच एक 12 ज प्रकाश/ मक्खियों एक मानक cornmeal खिलाया-गुड़ प्रयोगशाला आहार जब तक अंयथा उल्लेख कर रहे हैं । ब्याज की प्रत्येक जीनोटाइप के लिए चैंबर बिछाने तैयार एप्पल रस का उपयोग प्लेटें, प्लेट प्रति खमीर पेस्ट की एक बूंद, और 6 ऑउंस । प्लास्टिक की बोतलों अंडे कि लार्वा में रची जाएगी इकट्ठा करने के लिए । सेब रस आगार प्लेटें तैयार करने के लिए, ३५ मिमी x 10 मिमी पेट्री व्यंजन ¾-पूर्ण के साथ 3% की दुकान में भंग आगर-सेब का रस खरीदा । उपयोग तक एक फ्रिज में जम प्लेटों की दुकान । एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में, स्टोर का मिश्रण-खमीर के प्रत्येक ग्राम के लिए पानी की 2 मिलीलीटर के अनुपात में आसुत जल के साथ सक्रिय सूखी खमीर खरीदा । पानी के साथ मिक्स खमीर एक गिलास सरगर्मी रॉड का उपयोग कर केचप की निरंतरता के साथ एक पेस्ट बनाने के लिए । खमीर और पानी के अनुपात के रूप में वांछित निरंतरता प्राप्त करने के लिए आवश्यक समायोजित करें । उपयोग के बीच एक रेफ्रिजरेटर में स्टोर खमीर पेस्ट । डी-बक की अनुमति के लिए ट्यूब कैप ढीला रखें । 6 ऑउंस में छोटे छेद पंच करने के लिए एक तेज सुई या चाकू का प्रयोग करें. स्क्वायर-नीचे की बोतलें बिछाने कक्षों के लिए वेंटिलेशन छेद के रूप में (.) । ढाब एक सेब का रस आगर प्लेट पर खमीर पेस्ट (~ व्यास में 3 मिमी) की एक छोटी सी जगह है । प्लेस वयस्क 6 ऑउंस में वांछित जीनोटाइप के मक्खियों । बोतल और टोपी बोतल सेब रस आगर प्लेट के साथ । प्लेट रबर बैंड के साथ बोतल को सुरक्षित करें । उल्टे, और एक मशीन में जगह वयस्कों अंडे देना करने के लिए अनुमति देते हैं । बदलें सेब-रस एक बिछाने कक्ष पर प्लेटों आगर दिन में दो बार (सुबह और शाम) । एक और 12 के लिए मशीन में प्रयुक्त प्लेटों को छोड़ दो-24 के लिए पहली instar लार्वा हैच अनुमति देने के लिए एच । एक पतली तूलिका या संग्रह उठाओ (लचीला पतली एक संभाल करने के लिए संलग्न सुई) का उपयोग कर पहली instar लार्वा लीजिए । प्लेस ५० पहले वांछित प्रयोगात्मक खाद्य प्रकार के एक खाद्य शीशी पर एक विशिष्ट जीनोटाइप के instar लार्वा विकसित करने के लिए और पूरा कायापलट, जबकि मशीन में स्थित (चित्रा 2ए) । व्यायाम उपचार (चित्रा 2ए) के लिए वयस्कों लीजिए । pupation पर, एक छोटी सी, नम तूलिका और खाली शीशियों में जगह के साथ प्यूपा इकट्ठा करने से पहले eclosion से वयस्क मक्खियों को रोकने के लिए लार्वा आहार को उजागर किया जा रहा है । स्थानांतरण वयस्क मानक प्रयोगशाला आहार के भोजन शीशियों के लिए मक्खियों के रूप में वे eclose । एक से पांच दिन बाद eclosion, सेक्स पर आधारित अलग मक्खियों । प्रत्येक प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों के लिए एकत्र वयस्कों के आधे नामित । बनाए रखने के प्रति शीशी ५० मक्खियों की एकाग्रता में मानक प्रयोगशाला आहार की शीशियों में मक्खियों । वयस्कों ताजा खाद्य शीशियों हर दो दिनों के लिए उंहें व्यायाम के दौरान अटक से रोकने के लिए स्थानांतरण । नए भोजन के लिए पूरक रहते खमीर के कई अनाज जोड़ें तुरंत मक्खियों शुरू करने से पहले ।नोट: यह एक जीवित खमीर पूरक के बिना मक्खियों को बनाए रखने के लिए संभव है, हम वयस्क पूरकता के साथ सबसे अच्छा प्रदर्शन मक्खियों कि पाया है. लाइव खमीर पूरकता एक चर है कि शोधकर्ता प्रयोगात्मक लक्ष्यों के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है । 3. व्यायाम प्रोटोकॉल व्यायाम के पहले दिन (1 दिन), पुश शीशी प्लग नियंत्रण शीशियों में अंतरिक्ष के 1 सेमी और भोजन और व्यायाम शीशियों में प्लग के बीच अंतरिक्ष के 6 सेमी छोड़ने के लिए (चित्रा 1C) ।नोट: नियंत्रण शीशियों व्यायाम मशीन पर जबकि स्थानांतरित करने के लिए मक्खियों के लिए सीमित स्थान होगा और इस प्रकार व्यायाम शीशियों की तुलना में बहुत कम आंदोलन में शामिल होगा मक्खियों. clamps में शीशियों प्लेस, और फिर मक्खियों दे 10 मशीन पर acclimate को मिनट (चित्रा 1बी) ।नोट: एक वैकल्पिक नियंत्रण के लिए व्यायाम मशीन से सटे benchtop पर प्रयोग करने वाली मक्खियों को बनाए रखने के लिए है (शीशी में) अंतरिक्ष के 6 सेमी के साथ सामांय रूप से स्थानांतरित करने के लिए । दोनों के सापेक्ष व्यायाम के समान परिणाम “TreadWheel पर 1 सेमी” और “benchtop पर 6 सेमी” नियंत्रण पाया गया है11। इलाज दोनों नियंत्रण और व्यायाम रोटेशन और आराम (चित्रा 1डी) की बारी डटकर साथ प्रति सप्ताह लगातार 5 दिनों के लिए निरंतर कमरे के तापमान पर मशीन पर रोटेशन के लिए मक्खियों ।नोट: एक निरंतर तापमान गतिविधि के स्तर पर तापमान के निराधार प्रभाव से बचने के लिए की जरूरत है । तापमान हेरफेर अध्ययन के लिए, एक मशीन के अंदर TW जगह के लिए व्यायाम प्रशिक्षण के दौरान तापमान उपचार को संशोधित । 1 दिन पर व्यायाम के ४ १५ मिनट मुक्केबाज़ी के लिए मशीन भागो । वैकल्पिक 5 मिनट आराम अवधि के साथ इन डटकर । निम्नलिखित दिनों में से प्रत्येक, मौजूदा व्यायाम डटकर में से एक के लिए व्यायाम के 5 मिनट जोड़ें । उदाहरण के लिए, 2 दिन पर, पहले अभ्यास मुक्केबाज़ी 20 मिनट लंबा है, लेकिन 15 मिनट लंबे समय में मुक्केबाज़ी के बाकी बनाए रखने के । 3 दिन पर, व्यायाम पहले दो मुक्केबाज़ी और निंनलिखित दो मुक्केबाज़ी के लिए 15 मिनट के दौरान 20 मिनट के लिए मक्खियों । 4 दिन पर, उपयोग 20 मिनट अंतिम मुक्केबाज़ी के अलावा सभी के लिए व्यायाम मुक्केबाज़ी, जो केवल 15 मिनट लंबा होना चाहिए । 5 दिन पर, सभी व्यायाम डटकर 20 मिनट लंबा रखें ।नोट: बाकी समय के दौरान, मक्खियों युक्त शीशियों सुरक्षित TW पर clamped रहना चाहिए । इन अवधियों के दौरान शीशियों का उन्मुखीकरण प्रासंगिक नहीं है क्योंकि सभी मक्खियों द्वारा अनुभव गुरुत्वाकर्षण बल एक ही दिशा से आ रहा होगा. एक दिन के लिए व्यायाम उपचार पूरा करने के बाद, अपने सामांय पदों के लिए भोजन की शीशी प्लग वापस और वापस अगले दिन तक उनकी मशीन के लिए मक्खियों । पूर्ण व्यायाम शासन के पूरा होने के बाद, anesthetize मानक मक्खी सह2 संज्ञाहरण तरीकों का उपयोग कर मक्खियों । फिर स्थानांतरण नई खाद्य शीशियों या ब्याज की phenotypic विशेषताओं के आकलन के लिए microcentrifuge ट्यूबों के लिए मक्खियों ।नोट: उदाहरण phenotypes चढ़ाई की क्षमता (भोजन की शीशी), ट्राइग्लिसराइड का भंडारण (microcentrifuge ट्यूब), या जीन अभिव्यक्ति (microcentrifuge ट्यूब) शामिल हैं । प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया जा करने के लिए आकलन के आधार पर उचित रूप से संग्रहीत नमूनों के साथ यहाँ रोका जा सकता है. रहने वाले मक्खियों को शामिल परख के अनुसार phenotypic परख के विशिष्ट लक्ष्यों के साथ तुरंत आयोजित की आवश्यकता होगी । 4. चढ़ाई मूल्यांकन व्यायाम प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद बाकी के एक दिन के बाद, परीक्षण जनरल एक तेजी से चलने नकारात्मक geotaxis (अंगूठी) का उपयोग कर प्रदर्शन चढ़ाई मक्खी-नकारात्मक geotaxis चढ़ाई परख22की तरह । 3. CO2 संज्ञाहरण का उपयोग कर खाली शीशियों में 10 मक्खियों के प्लेस समूहों (या पहले से ही हल अगर खाद्य शीशियों से सीधे दोहन) और भागने से मक्खियों को रोकने के लिए आयल फिल्म के साथ मुहर. मक्खियों को नई शीशी में acclimate करने के लिए कम से 10 मिनट दें । पर tipping से शीशियों को रोकने के लिए, टेप एक ~ 5 सेमी व्यास cardstock सर्कल शीशी के नीचे करने के लिए अतिरिक्त सतह क्षेत्र प्रदान करते हैं ।नोट: शीशी प्लग इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि वे ऊंचाई निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया शीशी के भाग में बाधा चढ़ी । प्लेस एक निर्मित टाइमर (एक टाइमर कैमरा आवेदन के साथ एक स्मार्ट फोन अच्छी तरह से काम करता है) के साथ एक घुड़सवार, स्थिर कैमरा के पूर्ण दृश्य में एक 1 सेमी x 1 सेमी ग्रिड के सामने 20 सेमी शीशियों । नल शीशियों धीरे काउंटर पर तीन बार सब नीचे शीशी के नीचे करने के लिए मक्खियों दस्तक करने के लिए । तीसरी बार नीचे शीशी दोहन के बाद, तुरंत 4 एस कैमरा टाइमर के लिए एक छवि पर कब्जा करने के लिए एक मक्खी द्वारा चढ़ाई ऊंचाई निर्धारित शुरू करते हैं ।नोट: दोहन के कारण मक्खियों की प्रतिक्रियाओं में भिन्नता को कम करने के लिए प्रत्येक व्यायाम नियंत्रण कंट्रास्ट में एक ही शोधकर्ता द्वारा और एक सुसंगत तीव्रता पर किया जाना चाहिए । दोहराएं चरण 4.1.3 दो बार, परीक्षणों के बीच कम से कम 1 मिनट आराम के साथ, प्रति शीशी तीन परीक्षणों के कुल उत्पादन । अंय विश्लेषण के लिए मक्खियों की रक्षा के लिए, तुरंत चढ़ाई परख के बाद पूरा किया गया है, फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में विसर्जन से मक्खियों फ्रीज । एक उथले, खुले में सबसे ऊपर देवर कुप्पी तरल नाइट्रोजन के साथ ~ 5 सेमी की गहराई तक भर का उपयोग करें । स्थानांतरण सह2 संज्ञाहरण का उपयोग कर छोटे microcentrifuge ट्यूबों के लिए मक्खियों और फिर देवर कुप्पी तरल नाइट्रोजन से भरा में ट्यूबों जगह है । वैकल्पिक रूप से, यदि भविष्य के विश्लेषण की आवश्यकता होती है सीओ2के परिहार, स्नैप फ्रीज सीधे उनके चढ़ाई शीशियों में उनकी शीशी के नीचे करने के लिए मक्खियों दोहन द्वारा, जबकि नीचे तरल नाइट्रोजन में जलमग्न है, और फिर जमे हुए मक्खियों हस्तांतरण करने के लिए microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग संदंश.नोट: तरल नाइट्रोजन क्रायोजेनिक है और केवल उचित सुरक्षात्मक उपकरणों और कमरे वेंटिलेशन के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए । ImageJ23 बहु-बिंदु चयन उपकरण का उपयोग करके प्रक्रिया छवियां । ImageJ के भीतर प्रसंस्करण के लिए एक छवि खोलो । प्रत्येक व्यक्ति मक्खी द्वारा चढ़ाई की दूरी की गणना करने के लिए पृष्ठभूमि ग्रिड कागज पर आधारित एक 1 सेमी स्केल सेट करें । पृष्ठभूमि ग्रिड कागज से एक 1 सेमी2 वर्ग के एक तरफ का पता लगाने के लिए उपकरण पट्टी से “लाइन उपकरण” का प्रयोग करें । “विश्लेषण” टैब पर क्लिक करें और “सेट पैमाने” का चयन करें । “ज्ञात दूरी” के रूप में सेट करें ‘ १.०० ‘ और ‘ लंबाई की इकाई ‘ के रूप में ‘ cm ‘, सुनिश्चित करें कि “वैश्विक” अनियंत्रित है, और पर क्लिक करें “ठीक है” । उपकरण पट्टी से “बहु सूत्री चयन” आइकन का चयन करें और छवि में शीशी के तल पर ज़ूम में । शीशी के निम्नतम भाग पर क्लिक करके शीशी के बहुत नीचे के रूप में पहला बिंदु निर्धारित करें. एक डेटा बिंदु के रूप में चिह्नित करने के लिए शीशी में प्रत्येक मक्खी के केंद्र पर क्लिक करें । ध्यान रखें कि प्रति शीशी कुल 11 अंक हैं, एक शीशी के नीचे अंकन और प्रत्येक मक्खी के लिए एक । “विश्लेषण” टैब पर क्लिक करें और का चयन करें “माप” मापा मूल्यों की एक तालिका उत्पन्न करने के लिए. तालिका को csv फ़ाइल के रूप में सहेजें । csv फ़ाइल को स्प्रेडशीट प्रोग्राम में खोलें और मापा गया मान तालिका में 1 से पॉइंट 2-11 के y-मानों को घटा कर प्रत्येक मक्खी द्वारा चढ़ाई गई सटीक दूरी की गणना करें । प्रत्येक छवि के लिए 4.3.6 के माध्यम से 4.3.1 चरण दोहराएँ । 5. ट्राइग्लिसराइड का भंडारण परख नोट: नमूने, मानक, ग्लिसरॉल मानक समाधान, और triglycerol काम परख भर में इस्तेमाल किया समाधान प्रोटोकॉल की अवधि के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए और फ्रिज में संग्रहित किया जाना चाहिए जब उपयोग में नहीं है । ग्लिसरॉल मानक समाधान का उपयोग करके मानक तैयार करें । खाली (ख) homogenization बफर के १,००० µ l को जोड़कर एक microcentrifuge ट्यूब लेबल b. 1 मानक (एस 2), २.५ मिलीग्राम/एमएल प्रति अच्छी तरह से, एक microcentrifuge ट्यूब के लिए ग्लिसरॉल मानक समाधान के १,००० µ एल जोड़ने के द्वारा एस 4 लेबल । मानक 2 (S2), १.२५ मिलीग्राम/एमएल प्रति ठीक है, जोड़कर ५०० µ एल के ग्लिसरॉल मानक समाधान के ५०० µ एल दिः2ओ के एक microcentrifuge ट्यूब में S2 लेबल । मानक 3 (S3), ०.६२५ मिलीग्राम/एमएल प्रति ठीक है, जोड़कर २५० µ एल के ग्लिसरॉल मानक समाधान के ७५० µ एल दिः2ओ के एक microcentrifuge ट्यूब में S3 लेबल । 4 मानक (s4), ०.३१२५ मिलीग्राम/एमएल प्रति अच्छी तरह से, diH20 के ८७५ µ एल को ग्लिसरॉल मानक समाधान के १२५ µ एल जोड़कर एक microcentrifuge ट्यूब में S4 लेबल । सीरम ट्राइग्लिसराइड निर्धारण किट से triglycerol काम समाधान तैयार करें । किट से फ्री ग्लिसरॉल रिएजेंट को दिः2O के ४० मिलीलीटर जोड़ें और बोतल पलटने से मिश्रण । बोतल पलटने से किट और मिश्रण से ट्राइग्लिसराइड समाधान करने के लिए दिः2ओ के 10 मिलीलीटर जोड़ें । triglycerol काम समाधान तैयार करने के लिए पलटने से ग्लिसरॉल एजेंट और ट्राइग्लिसराइड समाधान और मिश्रण गठबंधन.नोट: triglycerol काम समाधान ६० दिनों के लिए अच्छा है और ४ ९६ के नीचे प्रोटोकॉल का उपयोग किट प्रति अच्छी तरह से प्लेट परख पूरी कर सकते हैं । इस्तेमाल किया मात्रा आनुपातिक नीचे ९६-well प्लेट प्रारूप में उपयोग के लिए सरकारी सीरम ट्राइग्लिसराइड निर्धारण किट से स्केल कर रहे हैं. खाली और मानकों को ध्यान से सत्यापित एक ९६-अच्छी तरह से फ्लैट तली में प्रत्येक मानक के 5 µ l pipetting, तपसिल में स्पष्ट microplate (या quadruplicate के लिए खाली) । प्रत्येक अच्छी तरह से एक मानक युक्त करने के लिए Triglycerol काम समाधान के बिल्कुल १२५ µ एल जोड़ें । 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया के लिए समाधान की अनुमति दें । एक spectrophotometer में एक ९६ अच्छी तरह से थाली प्लेस और ५४० एनएम पर अवशोषक पढ़ें । एक मानक वक्र बनाने के लिए और आर2 मूल्य का मूल्यांकन करके मानकों की सटीकता की पुष्टि करने के लिए अवशोषक माप का उपयोग करें । यदि मानकों के लिए आर2 ०.९८ से कम है, फिर से मानकों को और अधिक सावधानी से तैयार । ट्राइग्लिसराइड संग्रहण14 के लिए परख के 1 दिन शुरू 10 जमे हुए मक्खियों युक्त microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग कर प्रत्येक ।नोट: एक दोहराने या मल्टी चैनल पिपेट इस कदम में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि एक परख में इस्तेमाल किया एजेंट की मात्रा बहुत सटीक और reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए सुसंगत होना चाहिए । हमारे अनुभव में, दोहराने और मल्टी चैनल पिपेट सटीकता और निरंतरता के इस डिग्री नहीं है । एक चैनल पिपेट से प्रत्येक aliquot नेत्रहीन गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्रयोगकर्ता द्वारा पुष्टि की जा सकती है और किसी भी एक चैनल पिपेट-विशिष्ट पूर्वाग्रहों एक ही डिग्री करने के लिए सभी नमूनों द्वारा अनुभव किया जाएगा । KH2पीओ4, ४०० µ एल के ०.५ एम EDTA के संयोजन द्वारा Homogenization बफर का २०० मिलीलीटर स्टॉक तैयार करें, और एक गिलास की बोतल में दिः2ओ के १९९.६ मिलीलीटर । homogenization बफर के ४० microcentrifuge 10 चढ़ाई परख के बाद जम वयस्कों युक्त ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए ठीक १०० µ एल जोड़ें । फिर, १८,००० g पर 30 s के लिए नमूने केंद्रापसारक एक मोटर चालित चक्की और मूसल (या ऊतक homogenization के एक अंय रूप) का उपयोग कर मक्खियों को पीसने के लिए एक दूधिया समाधान तैयार करते हैं । सुनिश्चित करें कि एक ताजा मूसल प्रत्येक नमूने के लिए प्रयोग किया जाता है । फिर, १८,००० g पर 2 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक पिपेट केवल शीर्ष ७५ नई microcentrifuge ट्यूबों में प्रत्येक ट्यूब से supernatant द्रव के µ एल । सुनिश्चित करें कि गोली से कोई मक्खी बिट्स पर स्थानांतरित कर रहे हैं । जगह नई ट्यूबों फ्रिज में रात भर । फ्रिज से दिन 1 नमूनों को हटाने के द्वारा ट्राइग्लिसराइड प्रोटोकॉल के दिन 2 शुरू.नोट: चरण ५.५ ५.४ के रूप में एक ही दिन प्रदर्शन किया जा सकता है, लेकिन हम ट्राइग्लिसराइड एकाग्रता के लिए संकेत रेफ्रिजरेटर में एक रात के बाद और अधिक मजबूत हो पाया है । हालांकि, चरण ५.४ और ५.५ के बीच का समय ३६ h से अधिक नहीं होना चाहिए । वैकल्पिक भंवर 10 एस और पिपेट 5 µ एल के लिए supernatant द्रव के साथ पहली ट्यूब एक साफ microcentrifuge ट्यूब में । नई microcentrifuge ट्यूब में ०.१५ मीटर NaCl के ९५ µ l को जोड़ें । अगर वांछित प्रोटीन की एक बाद परख के लिए-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में इन उपनमूना स्टोर ।नोट: जोड़ा NaCl समाधान के साथ supernatant के इन नमूनों के लिए प्रोटीन सामग्री का उपयोग शोधकर्ता पसंदीदा परख का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम ब्रैडफोर्ड विधि24का उपयोग करें । प्रोटीन सामग्री एक तरह से ट्राइग्लिसराइड सामग्री के उपाय मानकीकरण है, लेकिन शोधकर्ता भी व्यायाम और आहार भी प्रोटीन भंडारण को प्रभावित कर सकते है के बाद से इन अनुपात की व्याख्या में सतर्क किया जाना चाहिए । मूल supernatant शीशियों के लिए, भंवर 10 एस के लिए supernatant द्रव के साथ पहली ट्यूब, फिर एक ९६ के दो अलग कुओं में 5 µ एल-अच्छी तरह से microplate के उत्पादन के लिए तकनीकी प्रतिकृतियां । जो कुओं प्रत्येक नमूने के लिए उपयोग किया जाता है नोट करने के लिए सुनिश्चित करें । ३९ अंय ट्यूबों के लिए इस कदम को दोहराएं । पिपेट के ठीक 5 µ l को रिक् त के चार कुओं में microplate, और शेष कुओं के लिए, पिपेट µ में प्रत्येक मानक के ठीक 5 तपसिल l वास्तव में १२५ µ एल triglycerol एक अच्छी तरह से काम कर समाधान जोड़ें, और 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए समाधान की अनुमति दें । एक spectrophotometer में ९६-well थाली प्लेस और ५४० एनएम पर अवशोषक पढ़ें । मानकों से गणना की मानक वक्र का उपयोग कर (मिलीग्राम/एमएल) एकाग्रता में अवशोषित मूल्यों कन्वर्ट ।

Representative Results

हम विशेष रूप से कारकों है कि एक व्यक्ति के समग्र चयापचय स्वास्थ्य के लिए योगदान की पहचान करने में रुचि रखते हैं । यह पहले पाया गया कि जीनोटाइप द्वारा आहार बातचीत चयापचय लक्षण14में जनसंख्या के स्तर में भिन्नता के लिए काफी योगदान. इसका मतलब यह है कि प्रत्येक जीनोटाइप एक अद्वितीय और जटिल तरीके से पर्यावरण के मतभेदों का जवाब है । जीनोटाइप पर हमारे काम का विस्तार-द्वारा-पर्यावरण प्रभाव शारीरिक व्यायाम शामिल करने के लिए, हम TreadWheel, जो एक उच्च प्रवाह तरीके से पादी एरोबिक अंतराल प्रशिक्षण (AIT) के लिए बड़ी संख्या को उजागर करने में सक्षम है विकसित की है । स्थापित करने के लिए कि क्या TW पर व्यायाम चयापचय लक्षण प्रभावित, हम ओरेगन में ट्राइग्लिसराइड भंडारण मापा आर (ओरर) और y1w1 मक्खियों, आम wildtype मक्खियों (चित्रा 2बी-सी), और ‘ मक्खियों के खिलाफ उन मूल्यों सामान्यीकृत ‘ प्रोटीन एकाग्रता, के रूप में मूल रूप से मेंडेज़ एट अल में सूचना दी । 11. हम बहुभिंनरूपी विश्लेषण द्वारा डेटा का विश्लेषण (MANOVA) जीनोटाइप के लिए लेखांकन, सेक्स, व्यायाम उपचार (और उनके बातचीत), और प्रयोगात्मक ब्लॉक प्रभाव जैसे समय की प्रतिकृति और खाद्य शीशी और पाया गया कि वहां एक महत्वपूर्ण था जीनोटाइप-द्वारा-व्यायाम बातचीत (पी = ०.००१७) ट्राइग्लिसराइड भंडारण को प्रभावित. पुरुषों और महिलाओं के बीच एक महत्वपूर्ण यौन dimorphic प्रभाव था, महिलाओं की तुलना में अधिक ट्राइग्लिसराइड्स भंडारण पुरुषों के साथ (p < ०.०००१). हमने देखा है कि महिलाओं में, प्रयोग मक्खियों ने काफी कम ट्राइग्लिसराइड का स्तर उनके unयायाम समकक्षों (चित्रा 2बी, पी < 0.0001) से था । पुरुषों में, जबकि ट्राइग्लिसराइड संग्रहण में कमी में मनाया ओरेगन-R प्रयोग मक्खियों (के रूप में नियंत्रण की तुलना में) सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं था, ट्राइग्लिसराइड भंडारण में एक महत्वपूर्ण अंतर दो अलग लाइनों के बीच मनाया गया था (चित्रा 2C, p < 0.0001) । ध्यान दें कि प्रोटीन एकाग्रता के खिलाफ ट्राइग्लिसराइड एकाग्रता मानकीकरण समग्र मक्खी शरीर रचना अनुपात पर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, मक्खियों के विभिन्न समूहों के बीच प्रत्यक्ष ट्राइग्लिसराइड या प्रोटीन एकाग्रता की तुलना भी प्रदान कर सकते हैं व्यक्तिगत रूप से इन phenotypes पर व्यायाम के प्रभाव पर विशिष्ट जानकारी. वयस्क व्यायाम, सेक्स की तरह चर के बाद से, और जीनोटाइप ट्राइग्लिसराइड भंडारण को प्रभावित करने के लिए दिखाए जाते हैं, यह उम्मीद थी कि इन कारकों को भी अन्य phenotypes प्रभाव और आहार के साथ बातचीत. हम एक प्रतिनिधि से उठाया लार्वा wildtype Drosophila आनुवंशिक संदर्भ पैनल लाइन (DGRP १५३)25 पर या तो एक उच्च वसा या सामांय आहार और वयस्क मक्खियों में एक सप्ताह के लिए प्रेरित व्यायाम (चित्रा 2ए) । बाद में, हम एक अंगूठी की तरह नकारात्मक geotaxis परख की क्षमता चढ़ाई मापने के लिए प्रदर्शन किया । चढ़ाई परख एक मानक अंगूठी परख से भिंन थे; एक अंगूठी उपकरण के बजाय, आयल फिल्म के साथ शीशियों के उद्घाटन को कवर परख के दौरान मक्खियों घर के लिए इस्तेमाल किया गया । मूल रिंग परख के अंय पहलुओं, जैसे समय के रूप में शीशी के नीचे करने के लिए मक्खियों दोहन और फोटो लेने के बीच,22बनाए रखा गया । सभी उपचार समय प्रति दोहराने और उपचार ५९ व्यक्ति मक्खियों की एक ंयूनतम के साथ तीन अलग बार दोहराया गया । डेटा आहार, जीनोटाइप, सेक्स, व्यायाम उपचार के लिए MANOVA लेखांकन द्वारा विश्लेषण किया गया था (और उनके बातचीत), साथ ही साथ समय की प्रयोगात्मक ब्लॉक प्रभाव दोहराने, परख शीशी, और शीशी परख दोहराने । हमने पाया है कि व्यायाम महिलाओं के काफी उच्च चढ़ाई (पी < 0.005) जब अंय महिला उपचार (चित्रा 2डी) के किसी भी से उच्च वसा आहार पर पीछे । पुरुषों के लिए, यह देखा गया था कि व्यायाम केवल चढ़ाई में सुधार जब पुरुषों सामांय आहार पर उठाया गया है, और उन उच्च वसा वाले आहार पर उठाया कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन (चित्रा 2ई) दिखाया । हम भी महिलाओं की तुलना में अधिक चढ़ाई पुरुषों के साथ चढ़ाई में महत्वपूर्ण यौन dimorphic प्रभाव (पी < 0.0001) पाया । DGRP १५३ रेखा (चित्रा 2डी) महिलाओं के लिए एक सामांय आहार लेने (पी < 0.0001) से महिलाओं के लिए निंनलिखित व्यायाम चढ़ाई में कमी की आश्चर्यजनक परिणाम कैसे व्यायाम के इस प्रकार एक नहीं हो सकता है की एक उदाहरण है सभी पादी के लिए समान रूप से सकारात्मक हस्तक्षेप और अंय पर्यावरणीय कारकों पर आकस्मिक हो सकता है । मेंडेज़ एट अल में । 11, मादा से चार अंय आनुवंशिक उनके चढ़ाई प्रदर्शन के लिए परीक्षण के बाद एक सामांय आहार पर उठाया गया है सभी व्यायाम प्रशिक्षण के साथ बढ़ी चढ़ाई क्षमता दिखाया । यह पता चलता है कि प्रतिक्रिया DGRP १५३ में मनाया जीनोटाइप-विशिष्ट और नहीं TW व्यायाम उपचार के एक सामांय संपत्ति है । सेक्स, आहार, और व्यायाम उपचार समूहों में प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता इंगित करता है कि वहां महत्वपूर्ण सेक्स द्वारा आहार-व्यायाम बातचीत है कि लाइन की चढ़ाई की क्षमता को प्रभावित करता है (पी < 0.0001) । एक साथ ले लिया, परिणाम संकेत मिलता है कि एक वयस्क मक्खी चयापचय स्वास्थ्य पर व्यायाम के प्रभाव अपने सेक्स, जीनोटाइप, और लार्वा आहार का एक समारोह हो सकता है । phenotypic भिन्नता जीनोटाइप, पर्यावरण चर के जवाब में मनाया (जैसे, आहार और व्यायाम), और सेक्स भी अन्य अध्ययन में मनाया गया है11,12,14,15. इस प्रकार, TW और Drosophila चयापचय स्वास्थ्य को आकार देने आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली रणनीति हो सकता है । चित्रा 1 : TreadWheel व्यायाम मशीन । (क) मशीन ४८ शीशियों रखती है और एक समायोज्य गति सुविधा है । यहां प्रयोगों 4 rpm पर प्रदर्शन किया गया । (ख) व्यक्तिगत भोजन प्रयोगात्मक मक्खियों युक्त शीशियों एक घूर्णन धुरा से जुड़ी कोष्ठक में बोले गए थे । (ग) शीशी प्लग और भोजन के बीच की दूरी व्यायाम शीशियों के लिए 6 सेमी और नियंत्रण शीशियों के लिए 1 सेमी था । इसके बाद शीशी को व्यायाम के लिए मशीन पर रखा गया । (घ) 5 दिन व्युत्क्रम पिरामिड व्यायाम शासन वयस्क मक्खियों व्यायाम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । प्रत्येक दिन, एक अतिरिक्त पांच मिनट व्यायाम डटकर में से एक को जोड़ा गया था व्यायाम तीव्रता संवर्द्धित, जो मॉडल धीरज, अंतराल प्रशिक्षण रैंप । यह आंकड़ा मेंडेज़ एट अल से संशोधित किया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्रा 2 : दृश्य विधियों और प्रतिनिधि परिणाम । (क) लार्वा आहार और वयस्क व्यायाम संपर्क प्रभाव परीक्षण के लिए तरीके । लार्वा उच्च वसा या सामान्य प्रयोगशाला आहार पर उठाया गया था और eclosion पर सामान्य भोजन के लिए स्विच किया गया था । वयस्क मक्खियों सेक्स से अलग, प्रयोगात्मक समूहों में रखा और लगातार पांच दिनों के लिए प्रयोग किया गया । बाद में, एक अंगूठी की तरह नकारात्मक geotaxis चढ़ाई परख आयोजित किया गया था, और मक्खियों ट्राइग्लिसराइड माप के लिए जमे हुए थे । प्रतिनिधि ट्राइग्लिसराइड डेटा दो आनुवंशिक लाइनों के लिए दिखाए जाते हैं, ओरेगन आर और वाई1डब्ल्यू1 के लिए (बी) महिलाओं और (ग) पुरुषों. सभी मक्खियों एक सामांय आहार पर पीछे थे और वयस्कता में प्रयोग किया जाता है । भिंन अक्षरों के साथ स्तर एक पोस्ट हॉक विद्यार्थी के t-परीक्षण का उपयोग करके काफी भिंन (p < 0.05) होते हैं । यह आंकड़ा मेंडेज़ एट अल में रिपोर्ट डेटा का एक सबसेट शामिल हैं । 11. प्रतिनिधि चढ़ाई डेटा लाइन DGRP १५३ के लिए (घ) महिलाओं और (ई) पुरुषों के लिए दिखाए जाते हैं । प्रत्येक बिंदु तीन स्वतंत्र समय अंक भर में २३२ या अधिक व्यक्तियों के औसत चढ़ाई प्रदर्शन का प्रतिनिधित्व करता है । त्रुटि पट्टियां एक मानक त्रुटि दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । पूरक चित्रा 1: TreadWheel की एक विस्तृत योजनाबद्ध । (एक) दोहरी शीशी दबाना संरचना मशीन के लिए शीशियों संलग्न करने के लिए इस्तेमाल किया आरेख । (ख) मशीन के रोटेशन ड्राइव प्रणाली के इंटीरियर देखें । (ग) मशीन के सामने चेहरे के समानांतर प्रक्षेपण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । पूरक कोड फ़ाइल: TreadWheel. skp कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Discussion

व्यायाम यहां विस्तृत प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक Drosophila में कोमल व्यायाम उत्तेजित दिखाया गया है और एक नियंत्रित प्रयोगशाला11की स्थापना में धीरज व्यायाम अनुकरण किया जा सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जब शुरू में TreadWheel अवधारणा को विकसित करने, हम वाणिज्यिक उत्पादों है कि इसी तरह (जैसे, एक प्रयोगशाला rotisserie) प्रदर्शन संशोधित किया जा सकता है माना जाता है । हालांकि, हम अंततः इस दृष्टिकोण को खारिज कर दिया, एक कस्टम निर्मित डिजाइन का चयन क्योंकि वाणिज्यिक उपकरण एक पर्याप्त कम घूर्णन गति (4 rpm) और उच्च प्रवाह नमूना पीढ़ी के लिए पर्याप्त शीशी क्षमता का अभाव नहीं था ।

TW प्रोटोकॉल ही अनुसंधान विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, आवृत्ति और ‘ मक्खियों व्यायाम सरकारों की अवधि का समायोजन काम-बहिष्कार वे प्राप्त की तीव्रता को बदल सकते हैं । एक सप्ताह से अधिक समय तक प्रोटोकॉल का विस्तार करके या अन्य आयु समूहों के लिए, यह उम्र बढ़ने और विभिन्न उम्र से संबंधित रोगों पर व्यायाम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संभव होगा. हम अनुशंसा करते हैं कि अगर एक विस्तारित व्यायाम दृष्टिकोण लागू किया जाता है, तो प्रति सप्ताह कम-से-अधिक एक शेष दिन वसूली के लिए अनुमति देने के लिए जोड़ा जाना चाहिए । प्रदर्शन और सुधार के लिए शासन में अधिक से अधिक है कि उन सरकारों कि लगातार दैनिक व्यायाम12इस्तेमाल से एक वसूली दिन शामिल दिखाया गया था । इसके अलावा, हम व्यायाम मुक्केबाज़ी लंबाई पिछले 30 मिनट के बाद से आदी होना रोटेशन गति के लिए लगातार व्यायाम11के लंबे समय के बाद हो सकता है विस्तार के खिलाफ सावधानी से होगा । हम भी TW11पर अपनी गतिविधि के स्तर को बनाए रखने के लिए ‘ मक्खियों की प्रेरणा में आनुवंशिक विविधताओं मनाया । इस प्रकार, यदि अब मुक्केबाज़ी वांछित हैं, ‘ मक्खियों गतिविधि के स्तर की निगरानी पर विचार, के रूप में वातानाबे और15पहेली,21 TW अवधारणा के अपने संशोधन का वर्णन द्वारा प्रस्तुत की । अंय कारकों है कि विभिंन तापमान और नींद जाग पैटर्न, जो भी मक्खी आंदोलनों26,27को प्रभावित करने के लिए दिखाए जाते है शामिल हो सकता है ।

वहां के दौरान और प्रोटोकॉल पूरा करने के बाद उपलब्ध विश्लेषण के ढेर सारे शारीरिक, व्यवहार, और आणविक स्तर पर व्यायाम के प्रभाव का पता है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यायाम के epigenetic प्रभाव जानने की क्षमता है । अतिरिक्त चयापचय परख (जैसे, ग्लूकोज, ग्लाइकोजन, और प्रोटीन), कार्डियक प्रदर्शन, और भड़काऊ प्रतिक्रिया उपायों आगे का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रभाव व्यायाम मक्खी फिजियोलॉजी और शरीर रचना12,14 पर है ,24,28. विभिंन व्यवहार में परिवर्तन के रूप में व्यायाम प्रेरण, के साथ जुड़े परिवर्तनों को खिला व्यवहार, हरकत गतिविधि, और सोने, भी कैफे परख29 या गतिविधि की निगरानी उपकरणों की तरह उपकरणों का उपयोग कर मापा जा सकता है12,15 ,30. जीन अभिव्यक्ति और सेलुलर श्वसन में परिवर्तन अभ्यास के लिए जिंमेदार ठहराया भी qRT-पीसीआर11 और respirometry31जैसे तरीकों का उपयोग कर quantified जा सकता है । अंत में, Drosophila मूल्यवान आनुवंशिक संसाधन उपलब्ध है, जैसे कि Drosophila जेनेटिक्स संदर्भ पैनल 2 और Drosophila सिंथेटिक जनसंख्या संसाधन है कि शोधकर्ताओं मंच प्रदान करने के लिए प्रदर्शन मात्रात्मक आनुवंशिक अध्ययन25,३२। ये उपकरण मानचित्रण प्रयोगों, जैसे जीनोम चौड़ा संघ के अध्ययन और मात्रात्मक विशेषता Loci मानचित्रण, व्यायाम और आहार के साथ जुड़े उंमीदवार Loci की पहचान करने के लिए सक्षम करें ।

अध्ययन TreadWheel का उपयोग कर पूरा प्रदर्शन किया है कि, औसत पर, व्यायाम शरीर के वजन में कमी, कुल ट्राइग्लिसराइड का भंडारण, और ग्लाइकोजन, जबकि प्रोटीन सामग्री में वृद्धि और चढ़ाई प्रदर्शन11. इसके अतिरिक्त, वहां चर के लिए लिंग और शरीर के वजन के लिए पादी भर में व्यायाम, साथ ही ट्राइग्लिसराइड्स, प्रोटीन, ग्लाइकोजन, ग्लूकोज, और गतिविधि के स्तर11,15थे । जबकि पादी और सेक्स में व्यायाम और आहार के लिए प्रतिक्रिया की परिवर्तनशीलता की व्याख्या करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है और, कई बार, counterintuitive, यह प्राकृतिक आबादी में मनाया वास्तविक जैविक भिन्नता के स्रोतों को दर्शाता है. जैसा कि हम अंतर्निहित मेट्स की उच्च दरों में योगदान कारकों की विविधता को समझने का प्रयास करते हैं, उपकरण है कि मॉडल जीवों में इन कारकों के परीक्षण के द्वारा विभिंन योगदान कारकों की रिश्तेदार भूमिका अलग करना हमारी क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा व्यक्तिगत रोकथाम और उपचार के हस्तक्षेप को विकसित करने के लिए । पूरी तरह से व्यायाम की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए, इन कारकों में से प्रत्येक और कैसे वे बातचीत जब प्रयोगों का आयोजन और निष्कर्ष तैयार विचार किया जाना चाहिए ।

TW, सबसे अंय मक्खी व्यायाम मशीनों की तरह, अपने को फ्लाई गति यों तो क्षमता में सीमित है । हाल ही में, वातानाबे और पहेली घूर्णन व्यायाम ठहराव प्रणाली (REQS), एक TW एक गतिविधि की निगरानी इकाई (LAM25H) से Drosophila निगरानी प्रणाली श्रृंखला15,21के साथ संशोधित रीढ़ विकसित की है । TW की तरह, इस प्रणाली को रोटरी गति का उपयोग करता है धीरे व्यायाम प्रेरित करते हुए LAM25H हाथ का उपयोग करने ट्रैक और मात्रा में मक्खी गतिविधि है, लेकिन यह शीशियों की एक छोटी संख्या (३२ शीशियों) TW15से रखती है । उच्च-प्रवाह व्यायाम अध्ययनों के लिए, यदि गतिविधि ठहराव आवश्यक या वांछित नहीं है, तो TW अधिक से अधिक नमूना संख्या के लिए अनुमति देता है । TW डिजाइन भी अपने वर्तमान फार्म से संशोधित किया जा सकता शीशियों की एक बड़ी संख्या को समायोजित करने के लिए । इस प्रणाली, अंय मौजूदा व्यायाम विधियों के साथ साथ, कि व्यायाम स्थापित करने में मदद की Drosophila में ही प्राप्त नहीं है, लेकिन यह भी शारीरिक और आणविक प्रतिक्रियाओं की एक किस्म पर भौतिक गतिविधि के प्रभाव का निर्धारण अध्ययन किया जा सकता है 11,12,15. इस प्रकार, TW, मक्खियों में कोमल व्यायाम उत्प्रेरण के एक सिद्ध विधि के रूप में, जैविक प्रश्नों की एक बड़ी विविधता जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम जूली Jarnigan, मेरेडिथ Owens, राहेल हिल, ब्रेंडन मोये, लौरा Mafla, ओलिविया मछली, और मक्खी पशुपालन और छवि प्रसंस्करण के साथ उनकी मदद के लिए रीड लैब के बाकी शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । शॉन मेंडेज़ UAB मशीन की दुकान से सहायता के साथ मूल TreadWheel का निर्माण किया । इस अध्ययन के लिए धन NIH द्वारा प्रदान की गई थी-R01 जीएम ०९८८५६ LKR करने के लिए और KEL और BJW के लिए अलबामा के विश्वविद्यालय में स्नातक रचनात्मकता और अनुसंधान अकादमी ।

Materials

Materials for TreadWheel Construction:
Heavy Duty Vibration-Damping leveling Mount McMaster-Carr 60855K71 Quantity: 4
Stainless Steel Ball Bearing McMaster-Carr 57155K306 Quantity: 8
Plug-in Voltage Transformer (500MA, 120VAC input, 24 VAC output) McMaster-Carr 70235K16 Quantity: 1
Compact Square-Face DC Gear motor McMaster-Carr 6409K23 Quantity: 1
Tool Holder (clamps) McMaster-Carr 1723A22 Quantity: 5 (10x)
12L14 Carbon Steel Tight-Tolerance Rod McMaster-Carr 5227T24 Quantity: 1
Set Screw Shaft Collar McMaster-Carr 6432K13 Quantity: 8
Round-Belt Pulley McMaster-Carr 6284K51 Quantity: 5
Dart Controls – 25 Max RPM, Electric AC DC Motor McMaster-Carr 13DV 1A Quantity: 1
Materials for Fly Maintenace and Husbandry
6 oz Square Bottom Bottles (polypropylene) Genesee Scientific 32-130 Quantity: 1
35x10mm Petri Dishes VWR 82050-536 Quantity: 1
Narrow Drosophila vials Genesee Scientific 32-116 Quantity: 1
Flystuff Flypad Genesee Scientific 59-114 Quantity: 1
Blowgun, Mini Genesee Scientific 54-104 Quantity: 1
Materials for RING-like Assay:
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/ Quantity: 1
1 cM graph paper or drawn grid (at least 20 cM by 30 cM) various Quantity: 1
digital camera with timer or smart phone with camera timer app various Quantity: 1
Materials for Triglyceride Assay:
Dewar Flask VWR 14200-960 Quantity: 1
Serum Triglyceride Determination Kit Sigma Aldrich TRO100 Quantity: 1
Cordless Pestle Motor VWR 47747-370 Quantity: 1
Pestles VWR 47747-358 Quantity: 1
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Referências

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Lowman, K. E., Wyatt, B. J., Cunneely, O. P., Reed, L. K. The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (136), e57788, doi:10.3791/57788 (2018).
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