Nous présentons une technique de micromanipulation sans contact de vésicules, avec des gradients d’ion calcium localisée. La microinjection d’une solution d’ion calcium, à proximité d’une vésicule lipidique géant, est utilisée pour remodeler la membrane lipidique, aboutissent à l’obtention de protubérances tubulaires de membrane.
Dans une grande variété de processus cellulaires fondamentaux, comme le trafic de membrane et de l’apoptose, membrane cellulaire forme transitions se produisent en même temps que les variations locales de concentration en ions calcium. Les principaux composants moléculaires impliquées dans ces processus ont été identifiés ; Toutefois, l’interaction spécifique entre les gradients d’ions de calcium et des lipides dans la membrane cellulaire est beaucoup moins connue, principalement en raison de la nature complexe des cellules biologiques et le difficilement des régimes de l’observation. Pour combler cette lacune, une approche synthétique est implémentée avec succès pour faire apparaître l’effet localisé des ions calcium sur la membrane cellulaire imite. Établissant un imitateur pour ressembler à des conditions dans une cellule est un problème plusieurs fois. Tout d’abord, un modèle biomimétique suffisante avec les dimensions appropriées et composition de la membrane est nécessaire pour capturer les propriétés physiques des cellules. Deuxièmement, une configuration de micromanipulation est nécessaire pour offrir une petite quantité d’ions calcium à un emplacement particulier de membrane. Enfin, un système d’observation est nécessaire pour détecter et enregistrer la réponse de la membrane lipidique à la stimulation externe. Cet article propose une approche biomimétique détaillée pour l’étude de l’interaction ion-membrane de calcium, où un système de vésicules lipidiques, consistant en une vésicule unilamellaires géant (GUV) connectée à une vésicule multilamellaire (MLV), est exposé à un calcium localisé gradient formés à l’aide d’un système de micro-injection. La dynamique de l’influence ionique sur la membrane ont été observée à l’aide de la microscopie en fluorescence et comptabilisée au taux de trame vidéo. À la suite de la stimulation de la membrane, fortement courbé membrane tubulaire parties saillantes (MTP) formés à l’intérieur de la GUV, orientée loin de la membrane. L’approche décrite induit le remodelage de la membrane lipidique et de la production du PSG d’une manière tout à fait sans contact et contrôlée. Cette approche présente un moyen d’aborder les détails des interactions ion-membrane de calcium, offrant de nouvelles possibilités pour étudier les mécanismes de remodelage de la membrane cellulaire.
Le rôle des ions calcium dans les processus biologiques, plus précisément leur implication dans la signalisation, la division cellulaire et fusion membranaire, est l’objet de nombreuses études mécanistes1. La concentration en ions calcium cytoplasmique intracellulaire est l’ordre de 100 nM, tandis que le calcium dans les organites, telles que le réticulum endoplasmique et des vésicules sécrétrices mitochondries, atteignent des niveaux pouvant atteindre des dizaines de millimolars de concentration. Cela crée raide calcium ions gradient de concentration ordres de grandeur à travers les membranes intracellulaires2,3,4,5,6,7,8 ,,9. La concentration d’ions de calcium extracellulaire est d’environ 2 mM, et par conséquent, les variations de la concentration en ions calcium se produisent aux niveaux intracellulaires et extracellulaires. En outre, ces dernières études prouvent que l’ion calcium intracellulaire des événements de signalisation et de l’activité neuronale peut se produire dans les conditions des fluctuations locales des concentrations d’ions de calcium extracellulaire, ce qui indique l’importance de synchronisé intra – et extracellulaire de calcium ionique variations10.
Visant à comprendre les interactions entre les ions calcium et les membranes biologiques, une approche synthétique dans laquelle native des membranes cellulaires sont remplacées par des vésicules de bicouche lipidique a été implanté avec succès. Exposer des vésicules vers les solutions d’ions de calcium entraîne des changements dans les groupes de tête de lipide et d’emballage chaîne d’hydrocarbure, tension membranaire accrue et agrégation de vésicule, ainsi que la ségrégation des lipides et membrane phase transition11,12 ,13,14,15,16. Les propriétés des membranes lipidiques par exposition à des ions de calcium ont été étudiées en utilisant ces techniques expérimentales comme les rayons x, 1H-RMN et études spectroscopiques ou thermodynamique11,16, 17 , 18. dans ces études, la composition de la membrane est souvent à l’écoute pour ressembler au natif des membranes cellulaires et contient des lipides physiologiques comme la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE) et la phosphatidylsérine (PS). PS est particulièrement important dans la préparation de la vésicule artificielle parce que c’est un élément essentiel dans de nombreux processus cellulaires, y compris le trafic membranaire intracellulaire, l’exocytose et l’apoptose19,20.
La taille des vésicules lipidiques synthétisées varie souvent de nanomètres à plusieurs micromètres. Parmi les préparations différentes vésicules, vésicules unilamellaires géant (GUVs), qui sont plusieurs à quelques dizaines de micromètres de diamètre, sont d’une importance particulière en raison de leur taille relativement importante, ressemblant étroitement à des dimensions de l’individu cellules21 , 22 , 23. la surface disponible des GUVs permet l’effet des gradients chimiques locales sur les propriétés biophysiques de la membrane à étudier. En exposant une partie seulement de la surface de la membrane aux stimuli externes, la dynamique de la membrane peut être étudiée de plus près. Par exemple, il a été démontré qu’application localisée des gradients de pH ou de produit chimique à la surface de GUVs conduit à la formation de protrusions tubulaires, qui n’a été observé à vrac exposition24,25. Les différences observées dans le comportement de la membrane appellent développement méthode des systèmes single-vésicule interrogatoire pour obtenir des idées sur les mécanismes de remodelage de la membrane cellulaire.
S’appuyant sur les méthodes de micro-injection et micromanipulation depuis le début des années 190026,27, dans le cadre des plus récentes avancées des systèmes single-vésicule manipulation depuis les années 200023,28 , cet article présente une approche dans laquelle la membrane remodelage et la formation de protrusions tubulaires de la membrane (MTP) dans la membrane GUV sont générées en réponse à une demande locale d’ions calcium.
Notre approche utilise une vésicule complexe consistant en un GUV relié à une vésicule multilamellaire (MLV) comme un système de modèle de membrane biomimétique (Figure 1 a). Le VCP est nécessaire comme un réservoir de lipides pour le complexe à fournir du matériel de lipides à le GUV pendant l’exposition à un gradient d’ions calcium. Cette connexion permet le complexe compenser l’augmentation de la tension de la membrane au cours de remodelage induite et façonner la transition de la membrane GUV et fournir des lipides pour la croissance du PSG. En outre, le VCP facilite l’immobilisation surface car sa masse est plus grande par rapport à celle de la GUV. Les complexes de GUV-MLV, lorsque immobilisée sur un substrat solid, ont été précédemment utilisés pour produire les réseaux de nanotube-vésicule, étudier les interactions polymère-membrane et imitant les derniers stades de l’exocytose29,30, 31,32,,33.
Précédents protocoles utilisés extrait de soja lipides polaires (SPE) pour préparer les GUV-MLV complexes28. La SPE compose d’un mélange de phospholipides incluant PC (45,7 %), PE (22,1 %), phosphatidylinositol (PI, 18,4 %), l’acide phosphatidique (PA, 6,9 %) et un mélange d’autres lipides (6,9 %). Dans notre protocole ci-après, le mélange SPE est dopé avec 20 % de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sel de sodium) (DOPS) pour imiter le feuillet interne de la membrane plasmique. Un autre 1 % d’ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) est utilisé pour colorer la bicouche lipidique pour permettre un suivi de la retouche de membrane à l’aide de la microscopie de fluorescence. Les GUVs ont la composition lipidique symétrique à travers la bicouche et sont localement exposés à des concentrations de 5 mM de chlorure de calcium (CaCl2). Ces conditions expérimentales, avec une concentration en ions calcium élevé, imitent également le dépliant de la membrane externe des cellules apoptotiques, où les molécules de PS sont exprimés34. La formation des complexes GUV-MLV nécessite l’utilisation d’une méthode de réhydratation-déshydratation modifiée développée initialement par Criado et Keller35. Le protocole de préparation de vésicule comprend la formation d’une couche de lipides sec, qui est ensuite utilisée pour former de petites vésicules dans la solution. Cette solution est ensuite déshydratée et réhydratée pour former les complexes GUV-MLV finales. Figure 2 a -D illustre les principales étapes pour la préparation d’un immeuble typique de GUV-MLV.
Après la préparation de la vésicule est terminée et la vésicule complexe est immobilisée sur le substrat de verre, la technique de microinjection est utilisée pour fournir de petites quantités d’ions calcium au feuillet externe de la GUV grâce à une micropipette de verre ouvert-pointe. L’écoulement de la solution de calcium sur la pointe génère un gradient d’ions calcium localisée à la surface de la membrane GUV, menant au remodelage de la membrane et la production de la MTP. Les MTP est orientées loin de la source d’ions de calcium et se développer à l’intérieur de la GUV. Cette formation de MTP peut être contrôlée directement à l’aide de la microscopie en fluorescence et enregistrées à l’aide d’un appareil photo numérique. La figure 3 montre le montage expérimental utilisé pour produire le remodelage de la membrane. La formation de la MTP (Figure 2E et Figure 4) dans le présent Protocole montre un résultat contrasté au calcium ions exposition expériences réalisées dans des conditions de volume en vrac. Dans des conditions en vrac, les GUVs se rompent et forment des taches de membrane qui peuvent être observées à adhérer à la surface de verre25.
De plus amples renseignements sur la formation de complexes GUV-MLV, ainsi que les procédures d’exécution de la microinjection d’ions calcium, sont expliqués dans cet article. Les protocoles sont en grande partie axés sur microinjection d’ions calcium ; Toutefois, cette approche modifiable facilement devant servir à étudier les réponses de membrane en raison de l’exposition aux autres ions ou les protéines. En outre, la composition des vésicules peut être ajustée afin d’isoler les rôles de composant lipidique dans le processus de remodelage de la membrane. Le protocole présenté ne nécessite pas un équipement sophistiqué pour produire les complexes GUV-MLV et se caractérise par un haut degré de reproductibilité.
Biomimétique cellule systèmes permettent l’étude du comportement de la membrane lors de l’exposition à des stimuli externes tels que des ions, des protéines ou des nanoparticules. GUVs, étant un tel modèle, peuvent répondre aux changements dans l’environnement chimique en ajustant leur forme, ce qui implique souvent la formation de tubules des structures et des invaginations24,41,42,43 .
Cet article propose une approche visant à générer des MTP de manière sans contact via le remodelage de la surface GUV sur injection localisée des ions de calcium à la surface GUV. Le protocole décrit la préparation du complexe GUV-MLV, qui imite une membrane plasmique, ainsi que la manière d’employer une technique de microinjection pour générer le calcium gradients ioniques à proximité de la GUV de surface pour former MTP. La majorité des précédentes études expérimentales qui adressée interactions ion-membrane calcium exposés des vésicules lipidiques en bloc de calcium ion concentration14,17. Selon les conditions expérimentales, cette exposition en vrac peut entraîner une réponse différente de membrane avec aucun des protubérances tubulaire formés25.
La formation des complexes GUV-MLV est relativement simple et ne nécessite que des équipements de laboratoire standard, comme un évaporateur rotatif, cuve à ultrasons et dessiccateur à vide. Pourtant, il existe plusieurs étapes critiques à considérer lors de la préparation de la vésicule. Il est important de s’assurer que la déshydratation des vésicules est terminée (au cours de l’étape 2.3 du protocole) et un film sec de lipides circulaire contenant seulement une petite quantité de cristaux de sel se forme sur la surface de la lamelle de verre. Pendant l’expérience, attention manipulation de la solution de la vésicule, à l’aide de la solution mère de lipides fraîches dans le chloroforme, mais aussi un tampon HEPES fraîche, est essentiel pour le succès de la préparation des complexes GUV-MLV. En outre, un attachement sécurisant du complexe GUV-MLV à la surface du verre couvre-objet est crucial pour la micromanipulation et microinjection. Pour confirmer l’adhérence adéquate de la GUV-MLV complexe, une micropipette (sans débit d’injection) peut être utilisée pour pousser doucement sur la surface de GUV. Une vésicule fermement adhérée ne peut pas glisser le long de la surface au contact physique direct. Parce que les expériences sont effectuées dans une gouttelette de tampon ouvert, qui peut être interrogé pendant plusieurs heures, évaporation doit être prise en considération. L’évaporation de la gouttelette de tampon va changer les conditions osmotiques, qui pourraient affecter et déstabiliser les vésicules. Pour restaurer des conditions osmotiques, ajout périodique de l’eau pure à l’échantillon pour restaurer le volume d’origine renvoie le système à l’homéostasie.
Lorsque vous modifiez la composition lipidique de la membrane, il est crucial que les vésicules sont établis sous la forme d’un complexe de GUV-MLV parce que la canalisation principale permet de transférer le matériel de lipides à le GUV lors de la refonte de la membrane. Des études antérieures ont montré que remplacer les composants du mélange SPE avec des lipides purs, ou l’ajout de 5 à 30 % du cholestérol, permet également de GUV-MLV complexant28,44. La majorité des GUVs préparés est unilamellaires45.
En outre, lors de l’essai d’autres cations divalents, tels que les ions de magnésium, la formation de la MTP fortement dépend de la présence de DOPS chargées négativement dans le mélange de lipides. Sans DOPS, le PSG ne font pas dans les vésicules décrites dans le présent protocole. Aussi, les cations monovalents, tels que le potassium et de sodium, n’entraînent pas la formation de MTP, même dans les vésicules de DOPS contenant25.
Outre les étapes critiques en ce qui concerne la préparation et la manipulation des GUVs, il y a plusieurs facteurs importants à considérer lors de la procédure de microinjection. La microinjection réussie des ions calcium s’appuie fortement sur fonctionne correctement en verre micropipettes, qui sont préparés le jour de l’expérience. Il y a plusieurs facteurs qui pourraient causer une micropipette un dysfonctionnement. Une raison courante est une ouverture de l’extrémité obstruée. Particules lipidiques petites, qui sont des sous-produits de la préparation de la vésicule, sont dispersés dans la solution et ont tendance à adhérer à la pointe de la micropipette, générant ainsi un colmatage. Nettoyage de l’embout de la pipette est mieux fait en soulevant de la solution de la vésicule et lâchez-le retour près de la surface GUV. L’utilisation de la fonction de soufflage de la pompe de microinjection doit être évitée car elle se traduit par une injection massive d’ions calcium dans la solution en vrac. En outre, petites bulles d’air emprisonnés à l’intérieur de la micropipette empêchent microinjection appropriée, dans lequel cas la micropipette devrait être remplacé par un neuf. Bris de pointe peuvent être réduits significativement en plaçant le montage expérimental sur un tableau amortissement des vibrations pour réduire les oscillations de pointe.
En outre, les soins doivent être prises lors du choix d’un système d’observation, afin de minimiser le photoblanchiment tout en obtenant les meilleures images de résolution temporelle. La microscopie de fluorescence induite par laser de grand champ a été utilisée dans le présent protocole parce qu’il permet une fréquence d’acquisition relativement forte d’une image à une profondeur de sonde limitée objective. Par ailleurs, l’utilisation de la microscopie inversée permet la microinjection simultanée et l’observation des vésicules lipidiques et MTP.
Une des principales limites de la méthode présentée est l’exigence de beaucoup de travail manuel et de compétences suffisantes de micromanipulation. Parce que les complexes sont formés par un processus spontané de gonflement, la taille de la GUVs et VCP ne peut être contrôlée. En outre, ce protocole ne permet pas de contrôler la tension de la membrane des complexes préparés GUV-MLV, qui pourrait être nécessaire de recueillir des détails supplémentaires en ce qui concerne le remodelage de la membrane. Les GUVs sont connectés à la VCP avec le matériel de lipides fournissant ce dernier pour la croissance substantielle de la MTP dans une mesure qui seraient impossibles à réaliser en utilisant uniquement la membrane disponible à partir du GUVs. Le VCP contribue également à réduire les variations de tension de surface latérale dans le GUV-MLV complexe44, qui compliquerait les tentatives pour contrôler la tension de la vésicule à l’aide d’aspiration de la micropipette. Ce modèle de base de GUV-MLV fournit-il une tension basse qui imite mieux les régimes de tension trouvées dans les structures de la membrane cellulaire reliés aux réservoirs de membrane, comme la membrane des plis et des invaginations46. Dans le même temps, la technique d’aspiration micropipette peut être appliquée avec succès pour contrôler la tension de membrane dans GUVs unique. Par exemple, le travail de Graber et al. fourni des détails sur la formation des invaginations tubulaires de membrane dans GUVs unique lors de la liaison des ions calcium vers la membrane dans les conditions en vrac de tension divers régimes40. Enfin, la comparaison entre le comportement de la membrane à l’exposition locale et en vrac au calcium nécessite un contrôle amélioré de l’adhérence de la membrane à la surface, qui déborde le cadre du présent protocole.
Pour résumer, la technique proposée permet de remodelage de la membrane sans contact et de la formation de MTP lors d’une stimulation localisée avec les ions calcium. Applications futures de ce centre de méthode sur la traduction de systèmes synthétiques vésicule au natifs membranes biologiques, comme les bulles de la cellule. La méthode proposée peut être constituée avec les différents régimes d’interrogatoire unicellulaires, comme les patch clamp ou microélectrode ampérométrie, ou combinée avec localisée Chauffage stratégies31,47,,48. Tester l’effet des autres ions ou des molécules est simple et consiste à simplement remplacer les ions de calcium avec les molécules d’intérêt. En outre, des vésicules lipidiques synthétiques complexes peuvent être produits par le biais de fonctionnalisation de la membrane avec des protéines transmembranaires, ce qui peut élargir notre compréhension de la biophysique de la dynamique de remise en forme et de la membrane cellulaire cellule associée à la détection du local gradients chimiques. Enfin et surtout, une stimulation sans contact de la membrane lipidique peut également être traduite aux systèmes polymériques matière molle, offrant une base pour une plate-forme de nouvelle manipulation sans contact.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |