Nanomaterialer giver alsidig ordninger for kontrolleret terapeutisk levering til både grundforskning og translationel applikationer, men deres fabrikation ofte kræver ekspertise, som ikke er tilgængelig i de fleste biomedicinske laboratorier. Vi præsenterer her, protokoller for skalerbar fabrikation og terapeutiske belastning af forskelligartede selvsamlede nanocarriers ved hjælp af flash nanoprecipitation.
Nanomaterialer præsentere en bred vifte af muligheder for at tilpasse kontrolleret levering af enkelt og kombinerede molekylære nyttelast for terapeutiske og tænkelig andragender. Denne øget specificitet kan have stor klinisk betydning, herunder nedsat bivirkninger og lavere doser med højere potens. Derudover kan i situ målretning og kontrolleret graduering af specifikke celle subsets styrke in vitro og i vivo undersøgelser af grundlæggende biologiske fænomener og sonde cellefunktion. Desværre, den nødvendige ekspertise i nanoskala naturvidenskab, kemi og teknik ofte forbyde laboratorier uden erfaring i disse felter fra opdigte og tilpasning af nanomaterialer som værktøjer til deres undersøgelser eller køretøjer til deres terapeutiske strategier. Her give vi protokoller til syntese og skalerbar forsamling af en alsidig giftfri blok copolymer system imødekommenhed over for facile dannelsen og lastning af nanoskala køretøjer for biomedicinske programmer. Flash nanoprecipitation er præsenteret som en metode til hurtig fremstilling af forskellige nanocarriers fra poly(ethylene glycol) –bl-poly (propylen sulfid) copolymere. Disse protokoller vil tillade laboratorier med en bred vifte af ekspertise og ressourcer til let og reproducerbar Fremstil avanceret nanocarrier leveringssystemer til deres programmer. Design og konstruktion af et automatiseret instrument, der beskæftiger en højhastigheds sprøjten pumpe til at lette den flash nanoprecipitation behandle og for at give øget kontrol over homogenitet, størrelse, morfologi og belastning af polymersome nanocarriers er beskrevet.
Nanocarriers giver mulighed for kontrolleret levering af små og makromolekylære last, herunder aktive enheder, hvis ikke indkapslet, ville være enten meget nedbrydeligt og/eller for hydrofobe for administration i vivo. Af nanocarrier morfologier regelmæssigt fabrikeret, tilbyde polymere vesikler svarer til Liposomer (også kaldet polymersomes) evnen til at samtidig indlæse hydrofile og hydrofobe cargo1,2. Trods deres lovende fordele er polymersomes stadig sjældne i kliniske applikationer skyldes, dels at flere centrale udfordringer i deres fremstilling. Til klinisk brug skal polymersome formuleringer foretages i store, sterile og konsekvent partier.
En række teknikker kan bruges til form polymersomes fra diblock copolymer, såsom poly(ethylene glycol) –blok-poly (propylen sulfid) (PIND –bl– PPS), som indeholder opløsningsmiddel dispersion3, tynd film rehydrering1 , 4, mikrofluidik 5,6, og direkte hydrering7. Opløsningsmiddel spredning involverer lang inkubationstid gange i nærværelse af organiske opløsningsmidler, som kan denaturere nogle bioaktive nyttelast, ligesom proteiner. Tyndfilm rehydrering tilbyder ikke kontrol over polydispersity af den dannede polymersomes, ofte kræver dyre og tidskrævende ekstrudering teknikker til at opnå acceptable monodispersity. Både microfluids og direkte hydrering er desuden vanskeligt at skala til større produktionsmængder. Af de forskellige nanocarrier fabrikation metoder giver flash nanoprecipitation (FNP) mulighed for at foretage omfattende og reproducerbare formuleringer8,9,10. Mens FNP var tidligere forbeholdt formuleringen af solid core nanopartikler, vores lab har for nylig udvidet brug af FNP medtage konsekvent dannelsen af forskelligartede PIND –bl– PPS nanostrukturer morfologier11, 12, herunder polymersomes11 og bicontinuous nanospheres12. Vi fandt at FNP var i stand til at danne monodisperse formuleringer af polymersomes uden behov for ekstrudering, hvilket resulterer i overlegen polydispersity indeksværdier sammenlignet med ikke-ekstruderet polymersomes dannet af tynde film rehydrering og opløsningsmiddel dispersion 11. Bicontinuous nanospheres, med deres store hydrofobe domæner, ikke var i stand til at være dannet af tynde film rehydrering, trods danner under en række opløsningsmidler betingelser med FNP12.
Her, vi giver en detaljeret beskrivelse til syntese af PEG –bl– PPS diblock copolymer anvendes i polymersome dannelse, begrænset impingement jetfly (CIJ) mixer brugt til FNP, FNP protokol sig selv, og gennemførelsen af et automatiseret system til at reducere bruger variabilitet. Inkluderet er oplysninger om, hvordan til at sterilisere systemet tilstrækkeligt til at producere endotoxin-fri formuleringer til brug i vivoog repræsentative data vedrørende karakterisering af polymersomes dannet af FNP. Med disse oplysninger, vil læsere med interesse i at udnytte polymersomes for in vitro- og i vivo arbejde kunne fremstille deres egen sterile, monodisperse formuleringer. Læsere med erfaring i nanocarrier formuleringer og med polymer syntese ekspertise vil være i stand til hurtigt teste deres egen polymer systemer bruger FNP som en potentiel alternativ til deres nuværende formulering teknikker. Derudover kan de protokoller er beskrevet heri bruges som pædagogiske redskaber til formulering af nanocarriers i nanoteknologi laboratorium kurser.
Vi har givet detaljerede instruktioner til den hurtige fabrikation af polymersomes ved hjælp af PIND17–bl– PPS35-SH som diblock copolymer. Vesikulær polymersomes er den primære samlede morfologi samlet på dette forhold på hydrofile PIND og hydrofobe PPS blok molekylvægt. Når berørt flere gange, de har en diameter og polydispersity, der matcher polymersomes ekstruderet gennem en 200 nm membran efter at være blevet dannet via tyndfilm hydrering. Denne protokol eliminerer der…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender personale og instrumentation støtte fra strukturel biologi anlægget ved Northwestern University. Støtte fra R.H. Lurie omfattende Cancer Center i det nordvestlige Universitet og Northwestern University strukturel biologi faciliteter er anerkendt. Gatan K2 direkte elektron detektor blev købt med midler fra Chicago biomedicinsk konsortiet med støtte fra Searle midler på The Chicago Fællesskabet Trust. Vi takker også følgende faciliteter på Northwestern University: Keck tværfaglige overflade videnskab facilitet, strukturel biologi faciliteten, den biologiske Imaging facilitet, Center for avanceret Molekylær Imaging og analytisk Bionanotechnology udstyr kerne. Denne forskning blev støttet af National Science Foundation grant 1453576, nationale institutter for Health direktør ny Innovator pris 1DP2HL132390-01, Center for regenerativ Nanomedicin katalysator Award og 2014 McCormick katalysator Award. SDA var delvist understøttet af NIH predoctoral bioteknologi uddannelse Grant T32GM008449.
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit – 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
Linear Bearing Platform (Small) – 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
Linear Rail Shaft Guide/Support – 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
PicoBorg Reverse – Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |