Nanomaterialer har allsidige mekanismer kontrollert terapeutiske leveringsdatoen for både grunnleggende vitenskap og translasjonsforskning programmer, men deres fabrikasjon ofte krever kompetanse som er tilgjengelig i de fleste biomedisinsk laboratorier. Her presenterer vi protokoller for skalerbare fabrikasjon og terapeutiske lasting av ulike selv montert nanocarriers bruker flash nanoprecipitation.
Nanomaterialer presenterer en rekke alternativer for å tilpasse kontrollert levering av enkelt og kombinert molekylær nyttelast for terapeutisk og bildebehandling programmer. Denne økte spesifisitet kan ha klinisk inkludert redusert bivirkninger og lavere doser med sterkere. Videre kan i situ målretting og kontrollert modulering av bestemt celle delsett forbedre i vitro og i vivo undersøkelser av grunnleggende biologisk fenomen og undersøke celle-funksjonen. Dessverre har den nødvendige kompetanse i nanoskala vitenskap, kjemi og ingeniører ofte forbyr laboratorier uten erfaring i disse feltene fra fabrikasjon og tilpasse nanomaterialer som verktøy for sine undersøkelser eller kjøretøy for deres strategier. Her gir vi protokoller for syntese og skalerbar montering av et allsidig giftfri blokk copolymer system mottakelig for lettvinte dannelse og lasting av nanoskala biler for biomedisinsk programmer. Flash nanoprecipitation er presentert som en metode for rask fabrikasjon av ulike nanocarriers fra poly(ethylene glycol) –bl-poly (propylen sulfide) copolymers. Disse protokollene vil tillate laboratorier med et bredt spekter av kompetanse og ressurser til å enkelt og reproduserbar dikte avanserte nanocarrier leveringssystemer for programmer. Design og bygging av et automatisert instrument som sysselsetter en høyhastighets sprøytepumpe å lette flash nanoprecipitation prosessen og for å tillate forbedret kontroll over homogenitet, størrelse, morfologi og lasting av polymersome nanocarriers er beskrevet.
Nanocarriers tillate kontrollert levering av små og macromolecular Last, inkludert aktive enheter som, hvis ikke innkapslet, ville være enten svært nedbrytbart og/eller for hydrofobe for administrasjon i vivo. Nanocarrier morphologies regelmessig fabrikkert, tilby polymere blemmer tilsvarende liposomer (også kalt polymersomes) muligheten til å samtidig laste hydrofile og hydrofobe Last1,2. Til tross for deres lovende fordeler er polymersomes fremdeles sjeldne i klinisk bruk skyldes, delvis, flere viktige utfordringer i sin produksjon. For klinisk bruk må polymersome formuleringer gjøres i store, sterile og konsekvent grupper.
En rekke teknikker kan brukes til skjemaet polymersomes fra en diblock kopolymer, som poly(ethylene glycol) –blokk-poly (propylen sulfide) (PEG –bl– PPS), som inkluderer løsemiddel spredning3, tynnfilm rehydrering1 , 4, microfluidics 5,6og direkte hydration7. Løsemiddel spredning innebærer lang incubation ganger i nærvær av organiske løsemidler, som kan denature noen bioaktive payloads, som proteiner. Tynnfilm rehydrering tilbyr ikke kontroll over polydispersity av det dannet polymersomes, ofte krever dyre og tidkrevende ekstrudering teknikker for å oppnå akseptabel monodispersity. Videre er både microfluids og direkte hydrering vanskelig å skalere opp større produksjonsvolumer. Av ulike nanocarrier fabrikasjon metoder tilbyr flash nanoprecipitation (FNP) muligheten til å gjøre store og reproduserbar formuleringer8,9,10. Mens FNP var tidligere reservert for utformingen av solid kjerner nanopartikler, vår lab har nylig utvidet bruk av FNP med konsekvent dannelsen av ulike PEG –bl– PPS nanostructure morphologies11, 12, inkludert polymersomes11 og bicontinuous nanospheres12. Vi fant at FNP var stand til å danne monodisperse formuleringer av polymersomes uten behov for ekstrudering, noe som resulterer i overlegen polydispersity indeksverdier sammenlignet med ikke-ekstruderte polymersomes dannet av tynnfilm rehydrering og løsemiddel dispersjon 11. Bicontinuous nanospheres, med sine store hydrofobe domener, klarte ikke å være dannet av tynnfilm rehydration, til tross for danner under en rekke løsemiddel forhold med FNP12.
Her vil vi gi en detaljert beskrivelse for syntese av PEG –bl– PPS diblock copolymer brukes i polymersome-formasjonen, trange impingement jetfly (CIJ) blandebatteri brukes for FNP, FNP protokollen selv, og gjennomføringen av et automatisert system for å redusere bruker variasjon. Inkludert er informasjon om hvordan sterilize systemet tilstrekkelig for å produsere endotoxin-fri formuleringer for bruk i vivoog representant data om karakterisering av polymersomes dannet av FNP. Med denne informasjonen, vil leserne med interesse i å utnytte polymersomes for i vitro og vivo arbeid kunne dikte egne steril, monodisperse formuleringer. Lesere med erfaring i nanocarrier formuleringer og polymer syntese kompetanse vil kunne raskt teste sine egne polymer systemer bruker FNP som et potensielt alternativ til deres nåværende formulering teknikker. Protokollene beskrevet her kan i tillegg brukes som pedagogisk verktøy for utformingen av nanocarriers i nanoteknologi laboratorium kurs.
Vi gir detaljerte instruksjoner for rask fabrikasjon av polymersomes med PEG17–bl– PPS35-SH som diblock copolymer. Vesicula polymersomes er primære samlet morfologi samlet på dette forholdet hydrofile pinne og hydrofobe PPS blokk molekylvekt. Når impinged flere ganger, de har en diameter og polydispersity som tilsvarer polymersomes ekstrudert gjennom en 200 nm membran etter å ha blitt dannet via tynnfilm hydration. Denne protokollen dermed eliminerer behovet for ytterligere eks…
The authors have nothing to disclose.
Erkjenner vi ansatte og instrumentering støtte fra strukturell biologi anlegget ved Northwestern University. Støtten fra det R.H. Lurie omfattende Cancer Center av Northwestern universitetet og Northwestern University strukturell biologi fasilitetene er anerkjent. Et K2 direkte elektron detektoren ble kjøpt med midler gitt av Chicago biomedisinsk Consortium med støtte fra Searle midlene på The Chicago samfunnet Trust. Vi takker også følgende fasiliteter ved Northwestern University: Keck tverrfaglig overflaten Science anlegget, strukturell biologi anlegget, biologiske Imaging anlegget, Center for avansert molekylær Imaging og Analytical Bionanotechnology utstyr kjerne. Denne forskningen ble støttet av National Science Foundation grant 1453576, nasjonale institutter for helse direktør nye innovatør Award 1DP2HL132390-01, Center for regenerativ Nanomedicine Catalyst Award og 2014 McCormick katalysator Award. SDA var støttes delvis av NIH predoctoral bioteknologi trening Grant T32GM008449.
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit – 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
Linear Bearing Platform (Small) – 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
Linear Rail Shaft Guide/Support – 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
PicoBorg Reverse – Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |