Montaje rápido, escalable y la carga de proteínas bioactivas y los inmunoestimulantes en diversos Nanocarriers sintético vía Flash Nanoprecipitation
Summary
Nanomateriales ofrecen versátiles mecanismos de entrega terapéutica controlada para aplicaciones aplicadas y ciencia básica, pero su fabricación a menudo requiere conocimientos que no está disponible en laboratorios biomédicos más. Aquí, presentamos protocolos de fabricación escalable y carga terapéutica de diversos nanocarriers uno mismo-montado usando flash nanoprecipitation.
Abstract
Nanomateriales presentan una amplia gama de opciones para personalizar la entrega controlada de cargas moleculares individuales y combinados para aplicaciones terapéuticas y proyección de imagen. Esta especificidad creciente puede tener importantes implicaciones clínicas, incluyendo la disminución de efectos secundarios y dosis más bajas con mayor potencia. Además, el en situ dirigidos a modulación controlada de subconjuntos específicos de la célula puede mejorar las investigaciones in vitro e in vivo de fenómenos biológicos básicos y sonda en función de la célula. Por desgracia, los conocimientos requeridos en ciencia de la nanoescala, la química y la ingeniería a menudo prohíben laboratorios sin experiencia en estos campos de fabricación y personalización de nanomateriales como herramientas para sus investigaciones o vehículos para su estrategias terapéuticas. Aquí, le ofrecemos protocolos para la síntesis y ensamblaje escalable de un sistema de copolímero de bloque no tóxico versátil susceptible a la fácil formación y carga de los vehículos de escala nanométrica para aplicaciones biomédicas. Nanoprecipitation flash se presenta como una metodología para la fabricación rápida de diversas nanocarriers de poly(ethylene glycol) –bl-copolímeros de poli (sulfuro de propileno). Estos protocolos permitirá laboratorios con una amplia gama de conocimientos y recursos para fácil y reproducible fabricar nanocarrier avanzados sistemas para sus aplicaciones. Procesan de diseño y construcción de un instrumento automatizado que emplea una bomba de jeringa de alta velocidad para facilitar el nanoprecipitation flash y para permitir mayor control sobre la homogeneidad, tamaño, morfología y carga de nanocarriers de polymersome es se describe.
Introduction
Nanocarriers permiten la liberación controlada de carga pequeña y macromolecular, incluya entidades activas, que si no encapsulado, sería altamente degradable o demasiado hidrofóbico para administración en vivo. De las morfologías nanocarrier regularmente fabricadas, vesículas poliméricas análogas a liposomas (también llamados polymersomes) ofrecen la posibilidad de cargar simultáneamente hidrofílicos e hidrofóbicos carga1,2. A pesar de sus ventajas prometedoras polymersomes son todavía raros en aplicaciones clínicas debido, en parte, a varios retos en su fabricación. Para uso clínico, polymersome formulaciones deben ser en lotes a gran escala, estériles y consistentes.
Un número de técnicas puede utilizarse para forma polymersomes de un copolímero del diblock, tales como poly(ethylene glycol) –bloque-poli (sulfuro de propileno) (PEG –bl– PPS), que incluyen dispersión solvente3, película delgada rehidratación1 , 4, 5,de microfluídica6e hidratación directa7. Solvente dispersión implica tiempos de incubación en presencia de solventes orgánicos, que puedan desnaturalizar algunas cargas bioactivos, como las proteínas. Rehidratación de película delgada no ofrece control sobre la polidispersidad de la polymersomes formado, a menudo requiere técnicas de extrusión costoso y desperdiciador de tiempo para lograr monodispersity aceptable. Además, microfluids e hidratación directa son difíciles de escala para grandes volúmenes de producción. De los métodos de fabricación diferentes nanocarrier, flash nanoprecipitation (FNP) ofrece la posibilidad de hacer formulaciones a gran escala y reproducible8,9,10. Mientras que la FNP estaba reservado previamente para la formulación de nanopartículas de núcleo macizo, nuestro laboratorio ha ampliado recientemente el uso de FNP para incluir la formación constante de diversos PEG –bl– PPS nanoestructura morfologías11, 12, incluyendo polymersomes11 y bicontinuas nanoesferas12. Se encontró que la FNP fue capaz de formar monodispersa formulaciones de polymersomes sin necesidad de extrusión, resultando en valores de índice de polidispersidad superior comparados con no sacó polymersomes formado por dispersión de rehidratación y solvente de película delgada 11. bicontinuas nanoesferas, con sus grandes dominios hidrofóbicos, no fueron capaces de formar por rehidratación de película delgada, a pesar de formar un número de condiciones solvente con FNP12.
Aquí, ofrecemos una descripción detallada para la síntesis de la PEG – copolímero de diblockbl– PPS usado en la formación de polymersome, el mezclador de jets (CIJ) de choque confinado utilizado para la FNP, el FNP protocolo sí mismo y la implementación de un sistema automatizado para reducir la variabilidad del usuario. Información sobre cómo esterilizar el sistema lo suficiente como para producir formulaciones libres de endotoxinas para uso en vivoy datos representativos acerca de la caracterización de polymersomes formado por FNP está incluida. Con esta información, los lectores con interés en utilizar polymersomes para trabajo in vitro e in vivo podrán fabricar sus propias formulaciones monodispersa estéril. Lectores con experiencia en formulaciones nanocarrier y con conocimientos de síntesis del polímero será capaces de probar rápidamente sus propios sistemas de polímero mediante FNP como una alternativa posible a sus actuales técnicas de formulación. Además, los protocolos descritos pueden utilizarse como herramientas educativas para la formulación de nanocarriers en los cursos de laboratorio de nanotecnología.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos incluido instrucciones detalladas para la fabricación rápida de polymersomes usando PEG17–bl– PPS35-SH como el copolímero del diblock. Polymersomes vesiculares son la morfología total primaria montada en esta relación de PEG hidrofílica e hidrofóbico PPS bloque molecular peso. Cuando afectado varias veces, tienen un diámetro y polidispersidad que polymersomes sacada a través de una membrana nm 200 después de ser formado por hidratación de película delgada. Este pr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos instrumentación y personal de apoyan de la instalación de biología estructural en la Universidad de Northwestern. Se reconoce el apoyo de la derecha Lurie integral cáncer centro de la Universidad Northwestern y la instalaciones de la Universidad noroeste de biología estructural. El detector de electrones directo de Gatan K2 fue comprado con fondos proporcionados por el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en el Chicago Community Trust. También agradecemos a las siguientes instalaciones en Universidad del noroeste: el centro de ciencia de superficie interdisciplinario Keck, la instalación de biología estructural, la instalación de la proyección de imagen biológica, centro de imagen Molecular avanzada y el análisis Bionanomedicina equipo núcleo. Esta investigación fue apoyada por la beca de la Fundación Nacional de Ciencias 1453576, Director de los institutos de salud nacional Premio innovador nuevo 1DP2HL132390-01, centro para la concesión de catalizador de nanomedicina regenerativa y el 2014 McCormick catalizador premio. SDA fue apoyado en parte por NIH predoctoral biotecnología formación Grant T32GM008449.
Materials
| CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit – 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
| Linear Bearing Platform (Small) – 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
| Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
| Linear Rail Shaft Guide/Support – 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
| Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
| MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
| Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
| PicoBorg Reverse – Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
| Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
| Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
| Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
| Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
| Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
| Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
| Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
| Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
| Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
| Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
| Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
| Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
| Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| 1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
| Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
| Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
| CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
| HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
| RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |
Referências
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