Purification efficace et LC-MS/MS-based test développement pour dix-onze Translocation-2 5-méthylcytosine Dioxygenase
Summary
Nous présentons ici un protocole pour une purification efficace seule étape de l’humain sans balise active dix-onze translocation-2 (TET2) 5-méthylcytosine dioxygénase utilisant la chromatographie échangeuse d’ions et son dosage à l’aide d’une masse en tandem par chromatographie liquide spectrométrie (LC-MS/MS)-approche de base.
Abstract
La régulation de la transcription épigénétique médiée par la 5-méthylcytosine (5mC) a joué un rôle essentiel dans le développement eucaryote. La déméthylation de ces marques épigénétiques s’effectue par oxydation séquentielle de dix-onze translocation dioxygénases (TET1-3), suivie par la thymine-DNA glycosylase dépendant base excision de réparation. L’inactivation du gène TET2 due à des mutations génétiques ou par d’autres mécanismes épigénétiques est associée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de divers cancers, surtout des malignités hématopoïétiques. Nous décrivons ici une purification efficace seule étape d’enzymatiquement actif non balisés humaine TET2 dioxygénase chromatographie échangeuse de cations. Nous fournissons également une approche liquid chromatography-spectrométrie de masse (LC-MS/MS) qui peut séparer et quantifier les quatre bases normales de l’ADN (A, T, G et C), ainsi que les quatre bases de cytosine mis à jour le (méthyl-5, 5-hydroxyméthyle, formyl-5 et 5-carboxylique). Ce test peut être utilisé pour évaluer l’activité de type sauvage et mutant TET2 dioxygénases.
Introduction
La position de C5 des bases cytosine dans dinucléotides est le site de méthylation prédominant (5mCpG) dans les génomes de mammifères,1. En outre, un certain nombre d’études récentes ont mis au jour une vaste méthylation de cytosine C5 (5mC) dans des sites non-CpG (5mCpH, où H = A, T, ou C)2,3. modification de 5MC sert un silencieux transcriptionnel rétrotransposons endogènes et gènes promoteurs3,4,5. Méthylation de l’ADN à 5mC joue également un rôle important dans l’inactivation du chromosome X, l’empreinte génétique, reprogrammation nucléaire et expression de gène de tissu-spécifique5,6,7. La méthylation de la cytosine postées sur la C5 est réalisée par ADN méthyltransférases, et mutations de ces enzymes causent des défauts importants de développement8. L’enlèvement des marques 5mC commencent par TET1-3 5mC oxydases9,10. Ces dioxygénases TET-famille convertissent 5mC 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxylcytosine (5caC) par oxydation séquentielle étapes11,12,13. Enfin, thymine-DNA glycosylase remplace 5FC ou 5caC de cytosine non modifiée à l’aide de la base excision repair voie11.
Le gène humain de la TET2 a été identifié comme un gène muté fréquemment dans diverses malignités hématopoïétiques dont myelodysplastic syndromes (MDS)14,15,16, MDS-syndromes myéloprolifératifs () néoplasmes MDS-MPN) et la leucémie myéloïde aiguë (AML) originaires du MDS et MDS-NPP16. Les niveaux de modification 5hmC dans la moelle osseuse ADN sont plus faibles chez les patients présentant des mutations de TET2 par rapport à ceux qui ont le type sauvage (wt)-TET214. Un certain nombre de groupes ont développé des modèles de souris de TET2-knockout pour élucider leur rôle dans l’hématopoïèse normale et transformation myéloïde17,18,19,20. Ces souris avec des mutations dans le gène de TET2 ont été initialement normale et viable, mais qui se manifeste de diverses malignités hématopoïétiques comme ils âgés causant leur mort prématurée. Ces études ont montré le rôle important joué par la wt-TET2 dans la différenciation hématopoïétique normale. Dans ces modèles de souris hétérozygotes de cellules souches hématopoïétiques (TET2+/- CSH) et l’homozygote TET2– / – CSH avait un avantage concurrentiel sur les homozygotes wt-TET2 CSH à repeupler les lignées hématopoïétiques comme les deux TET2+/- et TET2– / – CSH développé diverses malignités hématopoïétiques17,18. Ces études démontrent que Sim1 de TET2 dioxygénase altère le développement des CSH et se traduit par des malignités hématopoïétiques.
Semblables à des souris présentant des mutations dans le gène TET2, la plupart des patients de leucémie manifestent Sim1 TET2 dioxygénase dactivité. Ces mutations somatiques hétérozygotes pour la plupart comprennent mutations cadre-Maj et non-sens dispersées dans tout le corps de gène de TET2 tandis que des mutations faux-sens qui sont les plus groupés dans le domaine de dioxygénase12. A ce jour, peu caractérisation de wt – et mutant-TET2 est rapportée dans la littérature principalement en raison de difficultés liées à la production de TET2 dioxygénase et son dosage21. Nous rapportons ici une simple purification seule étape de native TET2 dioxygénase chromatographie échangeuse d’ions. En outre, un test quantitatif de la LC-MS/MS a été optimisé et utilisé pour mesurer l’activité enzymatique de native TET2 dioxygénase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des mutations du gène TET2 sont quelques-uns des changements génétiques plus souvent détectés chez les patients atteints de divers cancers hématopoïétiques. À ce jour des centaines de différentes mutations TET2, incluent un non-sens, cadre-Maj et mutations faux-sens, ont été identifiées dans les patients de12. Les patients présentant des mutations de TET2 montrent des niveaux faibles de génomique 5hmC dans la moelle osseuse, comparée à ceux qui wt-TET214…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le département américain de la défense sous la forme d’un Idea Award (W81XWH-13-1-0174), l’anémie aplastique & la MDS subvention de la Fondation, et grant UMRB de M.M. Authors remercie Mohit Jaiswal et Subhradeep Bhar clonage initiale de TET2 dans le vecteur pDEST14.
Materials
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
Referências
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