Эффективное очищение и LC-MS/MS-на основе анализа развития для десяти-одиннадцати транслокации-2 5-метилцитозин Dioxygenase
Summary
Здесь мы представляем протокол для эффективной одного шага очистки активных непомеченным человека десять-одиннадцать транслокации-2 (TET2) 5-метилцитозин dioxygenase с помощью ионообменной хроматографии и его анализа, с помощью жидкой массы хроматографии тандем спектрометрия (LC-MS/MS)-подход на основе.
Abstract
Эпигеномные транскрипции регулирования, при посредничестве 5-метилцитозин (5мс) играет решающую роль в эукариотических развития. Деметилирования этих эпигенетических меток осуществляется путем последовательного окисления десять-одиннадцать транслокации dioxygenases (TET1-3), после ремонта glycosylase зависимых базовых иссечение тимин ДНК. Инактивация гена TET2 из-за генетической мутации или других эпигенетические механизмы связаны с плохим прогнозом у больных с различными рака, особенно кроветворных злокачественных опухолей. Здесь мы Опишите эффективной одного шага очистки ферментативно активной непомеченным человека TET2 dioxygenase с помощью хроматографии катионного обмена. Далее мы предоставляем жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS) подход, который можно отделить и количественно четыре обычных оснований ДНК (A, T, G и C), а также четырех баз модифицированных цитозином (5-метил, 5-гидроксиметил, 5-формил и 5-карбоксильных). Этот assay может использоваться для оценки деятельности дикого типа и мутантов TET2 dioxygenases.
Introduction
C5 позиция баз цитозина внутри CpG dinucleotides является преобладающим метилирования сайт (5mCpG) в млекопитающих геномов1. Кроме того, ряд недавних исследований обнаружили обширные метилирование цитозина C5 (5мс) в не CpG сайтах (5mCpH, где H = A, T, или C)2,3. модификация 5мс служит transcriptional глушителя на эндогенных retrotransposons и Джин промоутеров3,4,5. Метилирование ДНК на 5мс также играет важную роль в инактивации Х-хромосомы, Джин импринтинг, ядерной перепрограммирования и ткани специфических генов выражение5,6,7. Метилирование цитозина с позиции C5 осуществляется methyltransferases ДНК, и мутации в эти энзимы вызывают значительные пороки развития8. Удаление следов 5мс инициируются TET1-3 5мс оксидазы9,10. Эти тет семья dioxygenases превратить 5мс 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxylcytosine (5caC) путем последовательного окисления шаги11,12,13. Наконец тимин ДНК glycosylase заменяет 5fC или 5caC в неизмененном цитозин, с использованием базового иссечение ремонт путь11.
Человеческий геном TET2 была определена как часто мутировавших генов в различных гемопоэтических злокачественных опухолей, включая миелодиспластические синдромы (MDS)14,,1516, MDS-миелопролиферативных новообразования ( MDS-MPN) и острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), происходящих из MDS и MDS-MPN16. Уровни 5hmC модификации в костном мозге ДНК ниже у пациентов с TET2 мутации, по сравнению с теми с дикого типа (wt)-TET214. Ряд групп разработали модели мыши TET2-нокаут для уточнения его роли в нормальное кроветворение и миелоидного преобразования17,18,19,20. Эти мыши с мутациями в гене TET2 были первоначально нормальной и жизнеспособным, но проявляется различных злокачественных опухолей кроветворной, как они в возрасте вызывая их ранней смерти. Эти исследования показали важную роль, которую играют wt-TET2 в нормальные гемопоэтические дифференциации. В этих моделях мыши, гетерозиготных гемопоэтических стволовых клеток (TET2+ / СКК) и гомозиготных TET2– / – СКК были конкурентное преимущество перед СКК гомозиготных wt-TET2 в заселив гемопоэтических линии как оба TET2+ /- и TET2– / – СКК различных злокачественных опухолей кроветворной17,18. Эти исследования показывают, что haploinsufficiency TET2 dioxygenase изменяет развития СКК и приводит к гемопоэтических злокачественных опухолей.
Подобно мышей с мутациями в гене TET2, большинство больных лейкемией манифеста haploinsufficiency TET2 dioxygenase деятельности. Эти главным образом гетерозиготных соматические мутации включают рама shift и нонсенс мутации, рассеянных по всему телу гена TET2 во время Миссенс-мутации, которые являются наиболее сосредоточены в домен dioxygenase12. На сегодняшний день, маленькая характеристика wt – и мутанта TET2 сообщается в литературе главным образом из-за трудностей с производством TET2 dioxygenase и его пробирного21. Здесь мы приводим простой одношаговый очищение родной TET2 dioxygenase с помощью ионообменной хроматографии. Кроме того количественные assay LC-MS/MS был оптимизирован и используется для измерения Ферментативная активность родной TET2 dioxygenase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мутации в гене TET2 являются одними из наиболее часто обнаруживаемые генетические изменения у больных с различными гемопоэтических злокачественных. На сегодняшний день сотни различных TET2 мутации, которые включают нонсенс, рамка shift и Миссенс-мутации, были определены12пацие?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось министерством обороны США в виде идея премии (W81XWH-13-1-0174), апластической анемии и Грант Фонда MDS, и Грант UMRB м.м. авторам спасибо Mohit Jaiswal и Subhradeep Bhar для первоначального клонирования TET2 в pDEST14 вектора.
Materials
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
Referências
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum’s disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum’s disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
