Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme
Summary
Burada, on-on translocation-2 (TET2) iletişim kuralı etkin etiketsiz insan bir verimli tek adım arıtma için mevcut iyon değiştirme Kromatografi ve sıvı kromatografi-tandem mass kullanarak onun tahlil kullanarak 5-metilsitozin dioxygenase spektrometresi (LC-MS/MS)-yaklaşım alarak.
Abstract
5-metilsitozin tarafından (5mC) aracılı epigenetik transkripsiyon yönetmelik ökaryotik gelişiminde önemli bir rol oynamıştır. Demethylation bu epigenetik izlerini timin-DNA glycosylase bağımlı baz eksizyon tamiri tarafından takip sıralı oksidasyon on-on translocation dioxygenases (TET1-3), tarafından sağlanır. TET2 gen genetik mutasyonlar nedeniyle veya diğer epigenetik mekanizmalar tarafından inactivation çeşitli kanserler, özellikle hematopoetik maligniteler olan hastalarda kötü prognoz ile ilişkilidir. Burada, enzimatik etkin etiketsiz insan TET2 dioxygenase ba * exchange Kromatografi kullanarak verimli tek adım arınma açıklayın. Biz daha fazla ayrı ve dört normal DNA baz (A, T, G ve C), (5-metil, 5-hydroxymethyl, 5-formyl ve 5-karboksil) dört değiştirilmiş sitozin baz yanı sıra ölçmek bir sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yaklaşım sağlar. Bu tahlil etkinlik vahşi türü ve mutant TET2 dioxygenases değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
C5 sitozin üsleri KSY dinucleotides içinde (5mCpG) baskın metilasyonu sitedeki memeli genleri1konumudur. Buna ek olarak, son çalışmalar bir dizi sigara CpG siteler kapsamlı C5 sitozin metilasyonu (5mC) ortaya (5mCpH, nerede H = A, C veya T)2,3. 5mC değişiklik endojen retrotransposons ve gen Rehberleri3,4,5, transkripsiyon bir susturucu olarak hizmet vermektedir. DNA metilasyonu 5mC, aynı zamanda X kromozomu inactivation, gen sürecinden, nükleer yeniden programlama ve doku özel gen ifade5,6,7önemli rol oynar. C5 konumundaki sitozin metilasyonu DNA methyltransferases tarafından yürütülen ve önemli gelişimsel kusurlar8bu enzimler mutasyonların neden. 5mC işaretleri kaldırılması TET1-3 5mC oxidases9,10tarafından başlatılan. Bu TET-aile dioxygenases 5mC değiştirmek içine 5-arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) ve 5-carboxylcytosine (5caC) tarafından sıralı oksidasyon adımları11,12,13. Son olarak, timin-DNA glycosylase 5 fC veya değiştirilmemiş sitozin baz eksizyon tamir yol11kullanarak için 5caC yerini alır.
İnsan TET2 gen myelodisplastik sendrom (MDS)14,15,16, MDS miyoproliferatif neoplazmlar () de dahil olmak üzere çeşitli hematopoetik maligniteler sık mutasyona uğramış bir gen olarak tespit edildi MDS-MPN) ve MDS ve MDS-MPN16kaynaklanan akut miyeloid lösemi (AML). Vahşi türü (wt) olanlar karşılaştırıldığında TET2 mutasyonları ile kemik iliği DNA 5hmC değişiklik düzeyde hastalarda alt-TET214. Grup sayısı normal hematopoiesis ve myeloid dönüştürme17,18,19,20rolünü aydınlatmak için TET2-nakavt fare modelleri geliştirdi. Bu fareler TET2 gen mutasyonları ile başlangıçta normal ve uygun, ama onlar kendi erken ölümüne neden olan yaşlı gibi çeşitli hematopoetik maligniteler ortaya. Bu çalışmalar normal hematopoetik ayrımında wt TET2 oynadığı önemli roller gösterdi. Bu fare modelleri, heterozigoz hematopoetik kök hücre (TET2+ / HSCs) ve homozigoz TET2– / – HSCs hematopoetik soy kullanıma her iki TET2+/- içinde homozigoz wt-TET2 HSCs rekabet avantajı vardı ve TET2– / – HSCs çeşitli hematopoetik maligniteler17,18. Bu çalışmalar dioxygenase HSCs gelişimi değiştirir ve hematopoetik maligniteler sonuç TET2 bu haploinsufficiency göstermektedir.
Benzer şekilde TET2 gen mutasyonları ile fareler, çoğu lösemi hasta haploinsufficiency TET2 dioxygenase faaliyet gösterecektir. Bu çoğunlukla Heterozigoz somatik mutasyon TET2 gen vücut çoğu missense mutasyon süre boyunca dağınık çerçeve-shift ve anlamsız mutasyon dahil dioxygenase etki alanı12‘ kümelenmiş. Bugüne kadar küçük karakterizasyonu wt mutant TET2, özellikle TET2 dioxygenase ve onun tahlil21üretimi ile zorluklar nedeniyle literatürde bildirilmektedir. Burada, yerel TET2 dioxygenase İyon Kromatografi kullanarak basit bir tek adım arıtma raporu. Ayrıca, nicel bir LC-MS/MS tahlil en iyi duruma getirilmiş ve yerli TET2 dioxygenase enzim aktivitesini ölçmek için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
TET2 gen mutasyonlar çeşitli hematopoetik maligniteler olan hastalarda en sık saptanan genetik değişiklikler vardır. Mutasyonların saçma, çerçeve-shift ve missense mutasyonlar içeren farklı TET2, bugüne kadar yüzlerce hastalar12tespit edilmiştir. TET2 mutasyonlar hastalarda kemik iliği wt-TET214olanlarla karşılaştırıldığında genomik 5hmC seviyesinin düşük gösterir. Mutant TET2 çakma deneyler Bu mutasyonlar 5hmC düzeyleri,<sup …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma ABD Savunma Bakanlığı bir fikir Ödülü (W81XWH-13-1-0174), aplastik anemi ve MDS Vakfı Hibe şeklinde tarafından finanse edildi ve UMRB grant mm yazarlara teşekkür Mohit Jaiswal ve Subhradeep Bhar ilk TET2 pDEST14 vektörde klonlama için.
Materials
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
Referências
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum’s disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum’s disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
