Aqui, apresentamos um protocolo para uma purificação eficiente passo a passo do ativo humano sem marcas de formatação a translocação de 10-11-2 (TET2) 5-metilcitosina dioxigenase usando cromatografia de permuta iónica e seu ensaio usando uma massa em tandem-cromatografia líquida espectrometria (LC-MS/MS)-com base em abordagem.
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Artigo de método
Purificação eficiente e desenvolvimento de ensaio baseado no LC-MS/MS para dez-onze translocação-2 5-metilcitosina dioxigenase
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O Regulamento epigenéticas transcrição mediado por 5-metilcitosina (5mC) tem desempenhado um papel crítico no desenvolvimento de eucariota. Desmetilação destas marcas epigenéticas é realizada pela oxidação sequencial por dez-onze translocação dioxygenases (TET1-3), seguida-se o reparo de excisão de base glycosylase-dependente de timina-DNA. Inativação do gene TET2 devido a mutações genéticas ou por outros mecanismos epigenéticos está associada um mau prognóstico em pacientes com diversos tipos de câncer, especialmente malignidades hematopoiéticas. Aqui, descrevemos uma purificação eficiente passo a passo de dioxigenase TET2 enzimaticamente ativo não marcado humano usando a cromatografia de permuta catiónica. Nós fornecemos mais uma abordagem de líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS) que pode separar e quantificar as quatro bases de DNA normais (A, T, G e C), bem como as quatro bases citosina modificado (5-metil, 5-hidroximetil, formil-5 e 5-carboxila). Este ensaio pode ser usado para avaliar a atividade de tipo selvagem e mutante TET2 dioxygenases.
Introdução
A posição de C5 de bases citosina dentro dinucleotídeos CpG é o site de metilação predominante (5mCpG) em genomas de mamíferos1. Além disso, uma série de estudos recentes revelaram extensa C5 methylation do cytosine (5mC) em sites não-CpG (5mCpH, onde H = A, T, ou C)2,3. modificação de 5mC serve como um silenciador transcriptional em retrotransposons endógena e gene promotores3,4,5. Metilação do DNA no 5mC também tem um papel importante na inactivação do cromossoma X, impressão de gene, reprogr....
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Protocolo
1. clonagem e purificação de dioxigenase TET2 humana sem marcas de formatação
- Clonagem humana TET2 dioxigenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) para o vetor de destino de pDEST14 usando a técnica de recombinação site-specific como descrito anteriormente,22.
Nota: Estudos anteriores demonstraram que o domínio C-terminal TET2 dioxigenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) é o mínimo domínio cataliticamente ativo21,23. Para expressar o domínio de dioxigenase TET2 não marcado usando o vetor de pDONR221, Shine Dalgarno e Kozak sequências foram incorporadas no primer para a frente durante ....
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Resultados
Modificação dinâmica de 5mC em DNA por TET-família dioxygenases tem um papel importante no Regulamento transcriptional epigenético. TET2 dioxigenase é frequentemente mutado em diversas malignidades hematopoiéticas12. Para investigar o papel da enzima TET2 no desenvolvimento normal e a doença, nós temos clonado seu domínio mínimo cataliticamente ativo sem qualquer marca de afinidade para o vetor de pDEST1422. A dioxigenase TET2 não marcado fo.......
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Discussão
Mutações no gene TET2 são algumas das alterações genéticas mais frequentemente detectadas em pacientes com diversas malignidades hematopoiéticas. Até à data centenas de mutações TET2 diferentes, que incluem o absurdo, deslocamento de quadro e mutações missense, foram identificados em pacientes12. Pacientes com mutações TET2 mostram níveis baixos de 5hmC genômica na medula óssea, em comparação com aqueles com wt-TET214. TET2 mutantes bater-em experimentos t.......
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Divulgações
Os autores têm a declarar, sem interesses financeiros.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pelo departamento de defesa sob a forma de um prêmio Idea (W81XWH-13-1-0174), Anemia aplástica e MDS Foundation Grant, e grant UMRB M.M. Authors agradecer Mohit Jaiswal e Subhradeep Bhar clonagem inicial de TET2 no vetor pDEST14.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Sulfato de ferro (II) heptahidratado | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| &alfa;-ácido cetoglutárico (ácido 2-oxoglutárico) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| Ácido L-ascórbico | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético sal dissódico di-hidratado | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Acetato de amônio | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrila | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Água de grau HPLC | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo limpo e concentrador | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (fosfatase alcalina intestinal de bezerro) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morfolino) ácido etanossulfônico monohidratado] | Carbosynth | FM37015 | |
| cloreto de sódio | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-metilcitidina | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hidroximetialcitidina | TCI | D4220 | |
| 2'-Desoxicitidina-5-ácido carboxílico, sal de sódio | Berry & AMP; Associados | PY 7593 | |
| 5-Formi-2'-desoxicitidina | Berry & Associados | PY 7589 | |
| 2'-Deoxicitidina | Berry & Associates | PY 7216 | |
| Carbosynth | 2'-Deoxyadenosine | ND04011 | |
| Carbosynth | 2'-Deoxyguanosine | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Tecnologia de gateway | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Centrífuga Beckman Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| Ä Sistema FPLC KTA | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| Sistema de liofilização FreeZone 4.5 | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 coluna | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Espectrômetro de massa Q-Trap | AB Sciex | ||
| HPLC | HPLC Shimadzu | ||
| Coluna XK16/20 FPLC | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
Referências
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341
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Reimpressões e permissões
