线虫线虫中乳酸和丙酮酸细胞的小尺度比色测定
Summary
本文介绍了一种改良的小尺度萃取和比色法测定乳酸和丙酮酸在线虫中的含量.使用商用试剂盒时, 其灵敏度和准确度的技术发展非常重要。在萃取中蛋白质沉淀是定量测定细胞内代谢产物的关键步骤。
Abstract
乳酸和丙酮酸是细胞内能量代谢通路的关键中间体。监测细胞中的乳酸/丙酮酸比值有助于确定线粒体氧化磷酸化与有氧糖酵解之间年龄相关能量代谢是否失衡。在这里, 我们展示了用于乳酸和丙酮酸的商业色度测定试剂盒在模型有机体C. 线虫中的应用。近年来, 试剂制造商进行的研究和开发大大提高了比色/荧光试剂盒的灵敏度和准确度。改进后的试剂能够在线虫中使用96孔板的小尺度检测。一般来说, 荧光检测优于比色法的灵敏度;然而, 比色法更适合在普通实验室中使用。定量测定中的另一个重要问题是均匀化的C. 线虫样本的蛋白质沉淀。在我们的蛋白质沉淀方法中, 常用的铈沉淀剂 (三氯乙酸酸、高氯酸和偏磷酸酸) 用于样品制备。在均匀化过程中, 通过直接添加冷沉淀剂 (最终浓度为 5%) 制备无蛋白测定样品。
Introduction
乳酸和丙酮酸浓度被广泛认为是能量代谢的中间体, 与糖酵解的状态、三羧酸酸 (TCA) 循环和有氧生物细胞中的电子传输链有关。在糖酵解氧化葡萄糖到丙酮酸的一系列反应, 它位于一个新陈代谢的十字路口, 可以通过糖异生转化为碳水化合物, 通过乙酰 CoA, 脂肪酸和能量代谢, 和氨基酸丙氨酸。TCA 循环发生在足够的溶解氧的存在下, 是葡萄糖转化为能量的基础。特别是, 二次代谢的改变是一种有趣的现象, 其中糖酵解主要用于能源生产和有氧线粒体呼吸, 涉及 TCA 循环和电子传输链, 是下调在哺乳动物癌细胞1,2。我们最近发现, 在模型有机体线虫线虫(线虫) 的衰老过程中, 乳酸水平和随之而来的乳酸/丙酮酸 (L/P) 比率下降。同样, 我们发现, 哺乳动物肿瘤抑制 p53 ortholog 相比 CEP-1 在C. 线虫通过激活其转录目标3, 在与年龄有关的能量代谢变化中发挥重要作用。
在生物检测中, 如测定细胞中的乳酸和丙酮酸浓度, 比色/荧光试剂盒的灵敏度、准确度、样本大小和孵育时间都得到了显著改善。由于技术创新, 我们现在能够分析各种代谢产物和中间代谢产物, 而不需要大规模的C. 线虫的培养, 因为它的体积小, 很难得到。一般而言, 比色法测定的灵敏度小于荧光测定的量级;然而, 比色法更适合于普通实验室的设置。此外, 含有均质性和蛋白质沉淀的萃取技术对于定量测定线虫细胞中乳酸和丙酮酸浓度是至关重要的, 因为这种线虫被封闭在外骨骼中.称为角质层, 不同于哺乳动物培养细胞系4,5。在这里, 我们描述了使用商业色度测定试剂盒分析乳酸和丙酮酸浓度的协议, 包括从线虫中抽取样品的技巧。
Protocol
Representative Results
Discussion
在使用这些色度测定试剂盒时, 样品萃取中最关键的步骤是在C. 线虫中准确检测细胞乳酸和丙酮酸是均匀化过程中的蛋白质沉淀 (图 1)。没有必要使用聚四氟乙烯均质机, 因为其他均质机 (冲击和锥形组织磨床或珠磨机) 也适合小规模的蠕虫提取。在蛋白质沉淀之前, 我们没有检测到使用匀质器提取的测试样品中的乳酸和丙酮酸。此外, 乳酸和丙酮酸水平在使用超?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了大东文化大学对 Sumino 筌的专项研究资助的财政支持。
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
Referências
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).
- Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
- Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
- Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
- Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).
