Vi beskriver en modifisert småskala utvinning og kolorimetrisk analyser av laktat og pyruvate i Rundormer C. elegans. Når utnytte kommersiell analyse kits, er den tekniske utviklingen av deres følsomhet og nøyaktighet viktig. Protein nedbør i utvinning er det viktigste steget for kvantitative fastsettelse av intracellulær metabolitter.
Laktat og pyruvate er viktige intermediates av intracellulær energi metabolske veier. Overvåking laktat/pyruvate forholdet i celler bidrar til å avgjøre om det er en ubalanse i alder-relaterte energi metabolism mellom mitokondrie oxidative fosforylering og aerobic Glykolysen. Her viser vi utnyttelsen av kommersielle kolorimetrisk analysen kits for laktat og pyruvate i modellen organismen C. elegans. Nylig forbedret den sensitivitet og nøyaktigheten av kolorimetrisk/fluorimetric analysen kits mye av forskning og utvikling utført av reagens produsenter. Forbedret reagensene har aktivert bruk av småskala analyser med en 96-brønns plate i C. elegans. Generelt, er en fluorimetric analysen overlegen i følsomhet en kolorimetrisk analysen; Imidlertid er kolorimetrisk tilnærmingen mer egnet for bruk i vanlige laboratorier. I disse analyser for kvantitative besluttsomhet er protein utfelling av homogenisert C. elegans prøver. I vår protein nedbør metode, felles precipitants (f.eks., Trekloredikksyre, perchloric syre og metaphosphoric syre) brukes for eksempel forberedelse. En protein-fri analysen prøven er utarbeidet av direkte legge kaldt precipitant (siste konsentrasjon på 5%) under homogenisering.
Laktat og pyruvate konsentrasjoner er ansett som intermediates av energi metabolism, og er knyttet til USA Glykolysen, tricarboxylic syre (TCA) syklus og elektronet transportkjeden i cellene i aerobic organismer. En rekke reaksjoner i Glykolysen oksidere glukose til pyruvate, som ligger ved en metabolsk veiskille og kan konverteres karbohydrater gjennom Glukoneogenesen, fettsyrer og energi metabolisme gjennom acetyl-CoA og aminosyre alanin. TCA syklus oppstår under tilstedeværelsen av tilstrekkelig oppløst oksygen og er grunnleggende for konvertering av glukose til energi. Spesielt, endring av sekundær metabolismen er et interessant fenomen der Glykolysen brukes hovedsakelig for energiproduksjon og aerobic mitokondrie åndedrett, som innebærer TCA syklus og elektronet transportkjeden, er downregulated i pattedyr kreft celler1,2. Vi viste nylig at laktat nivåer og påfølgende laktat/pyruvate (L/P) forholdet minket i aldring i modellen organismen Caenorhabditis elegans (C. elegans). Likeledes, vi fant at pattedyr tumor suppressor p53 ortholog CEP-1 i C. elegans har en viktig rolle i alder-relaterte endringer av energi metabolism gjennom aktivering av det transcriptional mål3.
I biologiske metoder, for eksempel måling av laktat og pyruvate konsentrasjoner i celler, forbedret følsomhet, nøyaktighet, utvalgsstørrelsen og inkubasjon tid kolorimetrisk/fluorimetric analysen kits dramatisk. På grunn av teknologiske nyvinninger er vi nå kjøpedyktig analysere ulike metabolitter og mellomliggende metabolitter uten store kultur C. elegans, som er vanskelig gitt sin lille størrelse. Vanligvis er følsomheten til en kolorimetrisk analysen en størrelsesorden som er mindre enn en fluorimetric analysen; kolorimetrisk tilnærming er imidlertid mer egnet i innstilling felles laboratorier. Videre er en utvinning teknikk som inneholder homogenisering og protein nedbør avgjørende for kvantitative fastsettelse av laktat og pyruvate konsentrasjoner i C. elegans celler fordi denne Rundormer er omsluttet av en ytre skjelett kalt cuticle, i motsetning til pattedyr kulturperler cellen linjer4,5. Her beskriver vi en protokoll for å analysere laktat og pyruvate konsentrasjoner bruke kommersielle kolorimetrisk analysen prosjektpakker inkludert tips for eksempel utvinning fra C. elegans.
Når utnytte disse kolorimetrisk analysen kits, er det viktigste trinnet i prøven utvinning å oppdage mobilnettet laktat og pyruvate nøyaktig i C. elegans prosessen med protein nedbør i løpet homogenisering (figur 1). Det er ikke strengt nødvendig å bruke en Teflon homogenizer, som andre homogenizers (f.eks., Dounce og konisk vev kverner eller perle mills) er også egnet til småskala utvinning av ormer. Vi gjorde ikke merker mobilnettet laktat og pyruvate i test pr?…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av en spesiell forskningsstipend fra Daito Bunka University til Sumino Yanase.
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |