Småskala kolorimetrisk analyser av intracellulær laktat og Pyruvate i Rundormer Caenorhabditis elegans

Summary

Vi beskriver en modifisert småskala utvinning og kolorimetrisk analyser av laktat og pyruvate i Rundormer C. elegans. Når utnytte kommersiell analyse kits, er den tekniske utviklingen av deres følsomhet og nøyaktighet viktig. Protein nedbør i utvinning er det viktigste steget for kvantitative fastsettelse av intracellulær metabolitter.

Abstract

Laktat og pyruvate er viktige intermediates av intracellulær energi metabolske veier. Overvåking laktat/pyruvate forholdet i celler bidrar til å avgjøre om det er en ubalanse i alder-relaterte energi metabolism mellom mitokondrie oxidative fosforylering og aerobic Glykolysen. Her viser vi utnyttelsen av kommersielle kolorimetrisk analysen kits for laktat og pyruvate i modellen organismen C. elegans. Nylig forbedret den sensitivitet og nøyaktigheten av kolorimetrisk/fluorimetric analysen kits mye av forskning og utvikling utført av reagens produsenter. Forbedret reagensene har aktivert bruk av småskala analyser med en 96-brønns plate i C. elegans. Generelt, er en fluorimetric analysen overlegen i følsomhet en kolorimetrisk analysen; Imidlertid er kolorimetrisk tilnærmingen mer egnet for bruk i vanlige laboratorier. I disse analyser for kvantitative besluttsomhet er protein utfelling av homogenisert C. elegans prøver. I vår protein nedbør metode, felles precipitants (f.eks., Trekloredikksyre, perchloric syre og metaphosphoric syre) brukes for eksempel forberedelse. En protein-fri analysen prøven er utarbeidet av direkte legge kaldt precipitant (siste konsentrasjon på 5%) under homogenisering.

Introduction

Laktat og pyruvate konsentrasjoner er ansett som intermediates av energi metabolism, og er knyttet til USA Glykolysen, tricarboxylic syre (TCA) syklus og elektronet transportkjeden i cellene i aerobic organismer. En rekke reaksjoner i Glykolysen oksidere glukose til pyruvate, som ligger ved en metabolsk veiskille og kan konverteres karbohydrater gjennom Glukoneogenesen, fettsyrer og energi metabolisme gjennom acetyl-CoA og aminosyre alanin. TCA syklus oppstår under tilstedeværelsen av tilstrekkelig oppløst oksygen og er grunnleggende for konvertering av glukose til energi. Spesielt, endring av sekundær metabolismen er et interessant fenomen der Glykolysen brukes hovedsakelig for energiproduksjon og aerobic mitokondrie åndedrett, som innebærer TCA syklus og elektronet transportkjeden, er downregulated i pattedyr kreft celler^1,2. Vi viste nylig at laktat nivåer og påfølgende laktat/pyruvate (L/P) forholdet minket i aldring i modellen organismen Caenorhabditis elegans (C. elegans). Likeledes, vi fant at pattedyr tumor suppressor p53 ortholog CEP-1 i C. elegans har en viktig rolle i alder-relaterte endringer av energi metabolism gjennom aktivering av det transcriptional mål³.

I biologiske metoder, for eksempel måling av laktat og pyruvate konsentrasjoner i celler, forbedret følsomhet, nøyaktighet, utvalgsstørrelsen og inkubasjon tid kolorimetrisk/fluorimetric analysen kits dramatisk. På grunn av teknologiske nyvinninger er vi nå kjøpedyktig analysere ulike metabolitter og mellomliggende metabolitter uten store kultur C. elegans, som er vanskelig gitt sin lille størrelse. Vanligvis er følsomheten til en kolorimetrisk analysen en størrelsesorden som er mindre enn en fluorimetric analysen; kolorimetrisk tilnærming er imidlertid mer egnet i innstilling felles laboratorier. Videre er en utvinning teknikk som inneholder homogenisering og protein nedbør avgjørende for kvantitative fastsettelse av laktat og pyruvate konsentrasjoner i C. elegans celler fordi denne Rundormer er omsluttet av en ytre skjelett kalt cuticle, i motsetning til pattedyr kulturperler cellen linjer^4,5. Her beskriver vi en protokoll for å analysere laktat og pyruvate konsentrasjoner bruke kommersielle kolorimetrisk analysen prosjektpakker inkludert tips for eksempel utvinning fra C. elegans.

Protocol

1. synkronisert kultur C. elegans Før Såing, kultur Escherichia coli (E. coli) belastning OP50 over natten på 37 ° C i 300 mL av Luria-Bertani (LB) kjøttkraft flytende medium. Lagre den kultiverte OP50 på-4 ° C. For å være LB kjøttkraft flytende medium, bruk 10 g av tryptone, 5 g av gjærekstrakt, 10 g av NaCl og 1,5 mL 1 N NaOH, og legge til 1 L med deionisert vann. Autoclave.Merk: OP50 og C. elegans stammer er tilgjengelig fra Caenorhabditis genetikk C…

Representative Results

Bruker de kolorimetrisk analyser for kvantitative fastsettelse av laktat og pyruvate konsentrasjoner, viste vi nøyaktigheten av disse analyser sammenlignet med tidligere rapporter i C. elegans7,8. Her var prosessen med protein nedbør i prøven utvinning det mest avgjørende skrittet å generere nøyaktige verdier. For protein nedbør, felles precipitants (f.eks., TCA, PCA, eller metaphosphoric acid) kan brukes …

Discussion

Når utnytte disse kolorimetrisk analysen kits, er det viktigste trinnet i prøven utvinning å oppdage mobilnettet laktat og pyruvate nøyaktig i C. elegans prosessen med protein nedbør i løpet homogenisering (figur 1). Det er ikke strengt nødvendig å bruke en Teflon homogenizer, som andre homogenizers (f.eks., Dounce og konisk vev kverner eller perle mills) er også egnet til småskala utvinning av ormer. Vi gjorde ikke merker mobilnettet laktat og pyruvate i test pr?…

Materials

Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit	BioVision	#K607-100	colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate Assay Kit	BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	#23225	colorimetric assay; store at  room temperature
Trichloroacetic Acid	Wako Pure Chemical	#207-04955	store at room temperature
Teflon homogenizer	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton