En roman metning mutagenese tilnærming: Enkeltsteg karakteristikk av regulatoriske Protein bindende områder i RNA bruker Phosphorothioates
Summary
Proteiner som binder bestemt RNA sekvenser spille viktige roller i genuttrykk. Detaljert karakterisering av disse bindende områder er avgjørende for vår forståelse av genet regulering. Her beskrives et enkeltsteg tilnærming for metning mutagenese av protein-bindende RNA. Denne tilnærmingen er relevant for alle protein-bindende områder i RNA.
Abstract
Genreguleringen spiller en viktig rolle i utviklingen. Mange DNA og RNA-bindende proteiner binde sekvensene målet med høy spesifisitet kontrollere genuttrykk. Disse regulatoriske proteiner styre genuttrykk enten på nivået av DNA (transkripsjon) eller på nivået av RNA (pre-mRNA skjøting, polyadenylation, mRNA transport, forfall og oversettelse). Identifikasjon av regulatoriske sekvenser bidrar til å forstå ikke bare hvordan et gen er slått på eller av, men også hvilke nedstrøms gener er regulert av en bestemt regulatoriske protein. Her beskriver vi en ett-trinns tilnærming som gjør at metning mutagenese av et protein bindende område i RNA. Det innebærer doping DNA mal med ikke-vill-type nukleotider på binding området, syntese av separate RNAs med hver phosphorothioate nucleotide og isolasjon av den bundne fraksjon etter inkubasjon med protein. Forstyrrelser fra ikke-vill-type nukleotider resulterer i deres fortrinnsrett utelukkelse fra protein-bundet brøken. Dette er kontrollert av gel geleelektroforese etter selektiv kjemiske spalting med jod phosphodiester obligasjoner som inneholder phosphorothioates (phosphorothioate mutagenese eller PTM). Denne enkeltsteg metning mutagenese gjelder karakterisering av alle protein bindende områder i RNA.
Introduction
Genreguleringen spiller en viktig rolle i biologi. Gener kan reguleres på nivå med transkripsjon, pre-mRNA skjøting, 3 slutt dannelsen, RNA eksport, oversettelse, mRNA lokalisering, forfall, post-translasjonell modifikasjon/stabilitet, etc. begge DNA og RNA-bindende proteiner spiller nøkkelroller i genet regulering. Mens molekylær genetisk analyser har identifisert mange regulatoriske proteiner, bare en liten del av dem har vært preget fullt cellulære funksjoner eller bindende områder i vivo. Fylogenetiske sekvens analyse og mutagenese tilbyr supplerende tiltak for å karakterisere DNA eller RNA-protein interaksjoner.
RNA-bindende proteiner er viktige utviklingsprosesser, inkludert seksuell differensiering. Drosophila protein Sex-dødelige (SXL) eller sex-hovedbryter protein er fraværende i menn, men stede i kvinner. Den gjenkjenner uridine-rik sekvenser eller pyrimidine-traktater tilstøtende til bestemte skjøte områder i nedstrøms pre-mRNA mål (transformator, Sex-dødeligeog hann-spesifikk lethal2) i somatiske celler1,2 ,3,4. I tillegg regulerer den polyadenylation nettstedet bytte ved binding til uridine-rik polyadenylation enhancer sekvenser i enhancer av rudimentære (e(r)) transkripsjon5,6. SXL sannsynlig regulerer flere mål i den kvinnelige germline som gjenstår for å bli identifisert1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Vanligvis innebærer karakterisering av en bindende nettsted mutagenese, for eksempel ved sletting eller substitusjon av én eller flere nukleotider. Hvert område som mutant bindende, i forhold til vill-type RNA sekvensen, analyseres deretter bruke en serie med protein konsentrasjoner for å bestemme dens forpliktende tilhørighet (Kd eller likevekt dissosiasjon konstant) for protein steder. Kd er protein konsentrasjon nødvendig for å få 50% RNA bindende. Denne arbeidskrevende prosessen med detaljert mutagenese omfatter generasjon og analyse av mange mutanter-tre ikke-wild type nukleotider for hver posisjon i området bindende. Dermed er det behov for en alternativ tilnærming for raskere, enklere og rimelig metning mutagenese av protein bindende RNA.
Her beskriver vi en ett-trinns tilnærming som gjør at metning mutagenese av et protein bindende område i RNA. Det innebærer doping DNA mal med ikke-vill-type nukleotider på binding området, syntese av separate RNAs med hver phosphorothioate nucleotide og isolasjon av den bundne fraksjon etter inkubasjon med protein. Forstyrrelser fra ikke-vill-type nukleotider resulterer i deres fortrinnsrett utelukkelse fra protein-bundet brøken. Dette er kontrollert av gel geleelektroforese etter selektiv kjemiske spalting med jod phosphodiester obligasjoner som inneholder phosphorothioates (phosphorothioate mutagenese eller PTM). Denne enkeltsteg metning mutagenese gjelder karakterisering av alle protein bindende områder i RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenese har lenge vært brukt til å simulere protein bindende områder. Først kan en rekke mutanter, konstruert og testet individuelt i bindingen analyser analysere deres effekter på bindende affinitet. Mens en standard mutagenese tilnærming tilbyr en måte å analysere flere sekvenser, flere skritt involvert i standard tilnærming, som konstruere mutanter og utføre en rekke bindende reaksjoner for hver mutant, er arbeidskrevende og tidkrevende og ikke tillate metning mutagenese, spesielt for lengre sekvenser. An…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatteren Takk National Institutes of Health for siste finansiering og takk Michael R. Green for å syntetisere oligonucleotides.
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
Referências
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genética. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
