Un enfoque de mutagénesis de saturación novela: Solo paso caracterización de sitios en el ARN usando fosforotioatos de unión de proteína reguladora
Summary
Las proteínas que se unen a secuencias específicas de RNA desempeñan papeles críticos en la expresión génica. Caracterización detallada de estos sitios de Unión es crucial para nuestra comprensión de la regulación génica. Aquí, se describe un enfoque solo paso para la mutagénesis de la saturación de los sitios de unión a proteínas en el ARN. Este enfoque es relevante para todos los sitios de unión a proteínas en el ARN.
Abstract
Regulación de los genes desempeña un papel importante en el desarrollo. Numerosas proteínas de unión de ADN y ARN unen sus secuencias diana con alta especificidad para el control de la expresión génica. Estas proteínas reguladoras controlan la expresión génica a nivel de ADN (transcripción) o a nivel de RNA (splicing pre-mRNA, poliadenilación, transporte del mRNA, decaimiento y traducción). Identificación de secuencias reguladoras ayudan a entender no sólo cómo un gen es activado o desactivado, sino también qué genes aguas abajo están regulados por una proteína reguladora particular. Aquí, describimos un enfoque de un paso que permite la mutagénesis de saturación de un sitio de unión de la proteína en el ARN. Se trata de dopaje de la plantilla de la DNA con wild-type de nucleótidos dentro del sitio de Unión, síntesis de RNAs separados con cada nucleótido fosfotioato y el aislamiento de la fracción unida tras incubación con proteína. Interferencia de nucleótidos wild-type resulta en su exclusión preferencial de la fracción unida a las proteínas. Esto se controla por electroforesis del gel siguiendo la hendidura química selectiva con yodo de fosfodiéster que contiene fosforotioatos (mutagénesis fosfotioato o PTM). Este enfoque de mutagénesis de saturación solo paso es aplicable a la caracterización de cualquier sitio de unión de la proteína en el ARN.
Introduction
Regulación de los genes juega un papel importante en biología. Genes pueden ser regulados a nivel de transcripción splicing pre-mRNA, 3′ final de formación, exportación del RNA, traducción, localización de mRNA, decaimiento, estabilidad de modificación poste-de translación, etc. que ambos DNA y RNA-proteínas desempeñan un papel clave en la gene Reglamento. Mientras que los análisis genéticos moleculares han identificado numerosas proteínas reguladoras, solamente un subconjunto pequeño de ellos se han caracterizado completamente para sus funciones celulares o sitios de enlace en vivo. Mutagénesis y análisis filogenético de la secuencia ofrecen enfoques complementarios para caracterizar las interacciones entre proteínas DNA o RNA.
Proteínas RNA-que atan son importantes en procesos de desarrollo, incluyendo la diferenciación sexual. La proteína de Drosophila Sex-lethal (SXL) o la proteína sexo interruptor está ausente en los machos, pero presente en las hembras. Reconoce secuencias ricas en uridina o pirimidina-zonas adyacentes a sitios específicos del empalme en blancos de abajo pre-mRNA (transformador, sexo letaly lethal2 específicas del hombre) en células somáticas1,2 ,3,4. Además, regula el sitio de poliadenilación conmutación atando a las secuencias enhancer ricos en uridina poliadenilación en la transcripción potenciador de rudimentario (e)5,6. Probable de SXL regula objetivos adicionales en la línea germinal femenina que están pendientes de ser identificados1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Por lo general, caracterización de un sitio de Unión consiste en mutagénesis, por ejemplo, por eliminación o sustitución de uno o varios nucleótidos. Cada sitio de Unión mutante, en relación con la secuencia de ARN de tipo salvaje, luego se analiza mediante una serie de concentraciones de proteína para determinar su afinidad (Kd o equilibrio disociación constante) de la proteína de interés; Kd es la concentración de proteína necesaria para obtener la Unión del RNA de 50%. Este proceso requiere mucho trabajo de detallado mutagénesis implica la generación y análisis de numerosos mutantes — tres nucleótidos del tipo no salvaje para cada posición en el sitio de Unión. Así, hay una necesidad de un enfoque alternativo para la mutagénesis de la saturación más rápido, más simple y barato de sitios de unión de la proteína en el ARN.
Aquí, describimos un enfoque de un paso que permite la mutagénesis de saturación de un sitio de unión de la proteína en el ARN. Se trata de dopaje de la plantilla de la DNA con wild-type de nucleótidos dentro del sitio de Unión, síntesis de RNAs separados con cada nucleótido fosfotioato y el aislamiento de la fracción unida tras incubación con proteína. Interferencia de nucleótidos wild-type resulta en su exclusión preferencial de la fracción unida a las proteínas. Esto se controla por electroforesis del gel siguiendo la hendidura química selectiva con yodo de fosfodiéster que contiene fosforotioatos (mutagénesis fosfotioato o PTM). Este enfoque de mutagénesis de saturación solo paso es aplicable a la caracterización de cualquier sitio de unión de la proteína en el ARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagénesis durante mucho tiempo se ha utilizado para caracterizar sitios de unión de la proteína. En primer lugar, una serie de mutantes puede y de prueba individualmente en ensayos para analizar sus efectos sobre la afinidad de enlace de enlace. Mientras que un enfoque de mutagénesis estándar ofrece una forma de analizar varias secuencias, varios pasos involucrados en el enfoque estándar, tales como construcción de mutantes y realizar una serie de reacciones para cada mutante de atar, es laborioso y consume tiem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor agradece a los institutos nacionales de salud para la financiación de los últimos y gracias a Michael R. Green por síntesis de oligonucleótidos.
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
Referências
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