En roman mättnad mutagenes strategi: Enda steg karakterisering av reglerande proteinet bindningsställen i RNA med hjälp av Phosphorothioates
Summary
Proteiner som binder specifika RNA sekvenser spela avgörande roller i genuttryck. Detaljerad karakterisering av dessa bindande platser är avgörande för vår förståelse av genreglering. Här beskrivs en enda steg strategi för mättnad mutagenes av proteinbindning platser i RNA. Detta tillvägagångssätt är relevant för alla proteinbindning platser i RNA.
Abstract
Genreglering spelar en viktig roll i utveckling. Många DNA – och RNA-bindande proteiner binder deras mål sekvenser med hög specificitet att kontrollera genuttryck. Dessa reglerande proteiner styr genuttrycket antingen på nivån av DNA (transkription) eller på nivån av RNA (pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA transport, förfall och översättning). Identifiering av reglerande sekvenser hjälper till att förstå inte bara hur en gen är påslagen eller avstängd, men också vilka nedströms gener regleras genom ett särskilt regelverk protein. Här beskriver vi en one-step metod som tillåter mättnad mutagenes av ett protein bindningsställe i RNA. Det handlar om dopning DNA mall med icke-vildtyp nukleotider inom bindande platsen syntes av separata RNAs med varje phosphorothioate nucleotide och isolera den bunden fraktion efter inkubation med protein. Störningar från icke-vildtyp nukleotider resulterar i deras förmånliga uteslutning från den proteinbundet fraktionen. Detta övervakas av gelelektrofores efter selektiv kemiska klyvning med jod av phosphodiester obligationer som innehåller phosphorothioates (phosphorothioate mutagenes eller PTM). Detta steg mättnad mutagenes synsätt är tillämpligt på karakterisering av någon protein bindningsställe i RNA.
Introduction
Genreglering spelar en viktig roll i biologi. Gener kan regleras i nivå med transkription, pre-mRNA splicing, 3′ slutet bildandet, RNA export, översättning, mRNA lokalisering, förfall, posttranslationella modifieringen/stabilitet, etc. både DNA – och RNA-bindande proteiner spela nyckelroller i gen förordning. Medan molekylära genetiska analyser har identifierat ett flertal reglerande proteiner, endast en liten delmängd av dem har karaktäriserats fullständigt för deras cellulära funktioner eller bindande platser i vivo. Fylogenetiska analyser och mutagenes erbjuder kompletterande metoder för att karakterisera DNA – eller RNA-protein interaktioner.
RNA-bindande proteiner är viktiga utvecklingsprocesser, inklusive könsdifferentiering. Drosophila proteinet Sex-dödliga (SXL) eller sex-huvudströmbrytare proteinet är frånvarande i män, men för närvarande hos kvinnor. Det erkänner uridin-rika sekvenser eller pyrimidin-skrifter intill specifika splice platser i nedströms pre-mRNA mål (transformator, Sex-dödandeoch hane-specifika lethal2) i kroppsceller1,2 ,3,4. Dessutom reglerar det polyadenylation plats växling genom bindning till uridin-rika polyadenylation enhancer sekvenser i förstärkare av rudimentära (e(r)) Avskrift5,6. SXL sannolikt reglerar ytterligare mål i den kvinnliga könsceller som återstår vara identifierat1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Vanligtvis innebär karakterisering av ett bindningsställe mutagenes, exempelvis genom borttagande eller ersättning av enstaka eller flera nukleotider. Varje muterat bindningsställe, i förhållande till vildtyp RNA sekvensen, analyseras sedan med hjälp av en rad protein koncentrationer för att avgöra dess affinitet (K-d eller jämvikt dissociation konstant) för proteinet av intresse. Kd är proteinkoncentration krävs för att erhålla 50% RNA bindande. Detta arbetsintensiva processen för detaljerad mutagenes omfattar generation och analys av många mutanter — tre icke-vildtyp nukleotider för varje position i bindningsstället. Således finns det ett behov av en alternativ metod för snabbare, enklare och billiga mättnad mutagenes av protein bindningsställen i RNA.
Här beskriver vi en one-step metod som tillåter mättnad mutagenes av ett protein bindningsställe i RNA. Det handlar om dopning DNA mall med icke-vildtyp nukleotider inom bindande platsen syntes av separata RNAs med varje phosphorothioate nucleotide och isolera den bunden fraktion efter inkubation med protein. Störningar från icke-vildtyp nukleotider resulterar i deras förmånliga uteslutning från den proteinbundet fraktionen. Detta övervakas av gelelektrofores efter selektiv kemiska klyvning med jod av phosphodiester obligationer som innehåller phosphorothioates (phosphorothioate mutagenes eller PTM). Detta steg mättnad mutagenes synsätt är tillämpligt på karakterisering av någon protein bindningsställe i RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenes har länge använts för att karakterisera protein bindningsställen. Först, en serie av mutanter kan byggas och testas individuellt i bindande analyser att analysera deras effekter på bindande samhörighet. Medan en standard mutagenes strategi erbjuder ett sätt att analysera flera sekvenser, flera steg inblandade i standardmetoden, såsom att bygga mutanter och utföra en serie bindande reaktioner för varje mutant, är mödosam och tidskrävande och kan inte tillåta mättnad mutagenes, särskilt för län…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författaren tack den National Institutes of Health för tidigare finansiering och tack Michael R. Green för syntetisera oligonukleotider.
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
Referências
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genética. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
