En roman mætning mutagenese tilgang: Trinvist karakterisering af regulerende Protein bindende websteder i RNA ved hjælp af Phosphorothioates
Summary
Proteiner der binder specifik RNA sekvenser spiller vigtige roller i genekspression. Detaljeret beskrivelse af disse bindingssteder er afgørende for vores forståelse af genet. Her, er en trinvis fremgangsmåde for mætning mutagenese af protein bindingssteder i RNA beskrevet. Denne tilgang er relevant for alle protein bindingssteder i RNA.
Abstract
RIBOREGULATION spiller en vigtig rolle i udviklingen. Talrige DNA – og RNA-bindende proteiner binder deres mål sekvenser med høj specificitet styre genekspression. Disse regulerede proteiner kontrollerer genekspression enten på niveauet af DNA (transskription) eller på niveau med RNA (præ-mRNA-splicing, polyadenylation, mRNA transport, forfald og oversættelse). Identifikation af regulerende sekvenser hjælper med at forstå, ikke kun hvordan et gen er tændt eller slukket, men også hvilke downstream gener er reguleret af en bestemt regulerende protein. Her, beskriver vi en et-trins tilgang, der giver mulighed for mætning mutagenese af en protein bindingssted i RNA. Det drejer sig om doping DNA skabelon med ikke-wild-type nukleotider i bindingssted, syntese af separate RNA’er med hver phosphorothioate nukleotid og isolering af den bundne fraktion efter inkubation med protein. Interferens fra ikke-wild-type nukleotider resulterer i deres privilegerede udelukkelse fra protein-bundne fraktion. Dette er overvåget af gelelektroforese efter selektiv kemisk spaltning med jod af fosfodiesterbindinger indeholdende phosphorothioates (phosphorothioate mutagenese eller PTM). Denne enkelt-trins mætning mutagenese tilgang kan anvendes til karakterisering af enhver protein bindingssted i RNA.
Introduction
RIBOREGULATION spiller en vigtig rolle i biologi. Gener kan reguleres på niveau med transskription, pre-mRNA-splicing, 3′ enden dannelse, RNA eksport, oversættelse, mRNA lokalisering, forfald, posttranslationel modifikation/stabilitet, etc. både DNA – og RNA-bindende proteiner spiller vigtige roller i gen forordning. Mens molekylær genetiske analyser har identificeret talrige regulerede proteiner, kun en lille delmængde af dem er blevet karakteriseret fuldt ud til deres cellulære funktioner eller bindende sites in vivo. Fylogenetisk Sekvensanalyse og mutagenese tilbyde komplementære metoder til at karakterisere DNA – eller RNA-protein interaktioner.
RNA-bindende proteiner er vigtige i udviklingsprocesser, herunder seksuel orientering. Drosophila protein Sex-dødbringende (SXL) eller master sex-switch protein er fraværende i hanner, men nutid i hunner. Det genkender uridine-rige sekvenser eller pyrimidin-skrifter støder op til specifikke splice websteder i downstream pre-mRNA mål (transformer, Sex-dødbringendeog mand-specifik lethal2) i somatiske celler1,2 ,3,4. Desuden regulerer polyadenylation site skifte ved binding til uridine-rige polyadenylation forstærker sekvenser i forstærker af rudimentære (e(r)) udskrift5,6. SXL sandsynligvis regulerer yderligere mål i den kvindelige kønscelleoverførsel, der mangler for at blive identificeret1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Typisk, karakterisering af en bindingssted indebærer mutagenese, for eksempel ved sletning eller substitution af én eller flere nukleotider. Hver mutant bindingssted i forhold til wild-type RNA-sekvens, analyseres derefter ved hjælp af en række protein koncentrationer til at bestemme dets bindende affinitet (Kd eller ligevægt dissociation konstant) for protein af interesse; Kd er proteinkoncentration kræves for at opnå 50% RNA bindende. Denne arbejdskrævende proces af detaljerede mutagenese indebærer generation og analyse af talrige mutanter — tre vilde type nukleotider for hver position i bindingssted. Der er således behov for en alternativ tilgang til hurtigere, enklere og billig mætning mutagenese af protein bindingssteder i RNA.
Her, beskriver vi en et-trins tilgang, der giver mulighed for mætning mutagenese af en protein bindingssted i RNA. Det drejer sig om doping DNA skabelon med ikke-wild-type nukleotider i bindingssted, syntese af separate RNA’er med hver phosphorothioate nukleotid og isolering af den bundne fraktion efter inkubation med protein. Interferens fra ikke-wild-type nukleotider resulterer i deres privilegerede udelukkelse fra protein-bundne fraktion. Dette er overvåget af gelelektroforese efter selektiv kemisk spaltning med jod af fosfodiesterbindinger indeholdende phosphorothioates (phosphorothioate mutagenese eller PTM). Denne enkelt-trins mætning mutagenese tilgang kan anvendes til karakterisering af enhver protein bindingssted i RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenese har længe været anvendt til at karakterisere protein bindingssteder. Først, kan en række mutanter konstrueret og individuelt testet i bindende assays til at analysere deres virkninger på bindende affinitet. Mens en standard mutagenese tilgang tilbyder en måde at analysere flere sekvenser, flere trin involveret i standardmetoden, som opbygningen af mutanter og udfører en række bindende reaktioner for hver mutant, er besværlig og tidskrævende og kan ikke Tillad mætning mutagenese, især for længere s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatteren tak National Institutes of Health til sidste finansiering og tak Michael R. Green for syntese oligonukleotider.
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
Referências
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genética. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
