Phosphorothioates를 사용 하 여 RNA에서 사이트 바인딩 규제 단백질의 소설 포화 Mutagenesis 접근: 단일 단계 특성

Summary

특정 RNA 순서 묶는 단백질 유전자 발현에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 바인딩 사이트의 상세한 특성은 유전자 규칙의 우리의 이해를 위해 중요 합니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis에 대 한 단일-단계 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법은 모든 단백질 바인딩 사이트 RNA에 대 한 관련입니다.

Abstract

유전자 규칙 개발에 중요 한 역할을 한다. 수많은 DNA과 RNA 의무적인 단백질 높은 특이성 유전자 발현 제어를 가진 그들의 대상 시퀀스를 바인딩합니다. 이러한 규제 단백질 유전자 발현 DNA (전사)의 수준에서 또는 RNA (이전 mRNA 접합, polyadenylation, mRNA 전송, 부패, 및 번역)의 수준에서 제어합니다. 식별 규제 시퀀스의 유전자가 켜거나 전환 뿐만 아니라 또한 어떤 다운스트림 유전자 규정 하는 특정 단백질에 의해 통제 된다 이해 하는 데 도움이 됩니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis 있도록 단계 접근 방식을 설명 합니다. 그것은 사이트 내에서 바인딩, 각 phosphorothioate 뉴클레오티드와 별도 RNAs의 합성 및 단백질 외피 다음 바인딩된 분수의 절연 야생-타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 포함. 야생-타입 뉴클레오티드에서 간섭 결과 단백질 바인딩 부분에서 그들의 특혜 배제. 이 다음의 phosphodiester phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis 또는 PTM)를 포함 하는 요오드와 선택적 화학 분열 하는 젤 전기 이동 법에 의해 모니터링 됩니다. 이 단일 단계 포화 mutagenesis 접근 RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 특성에 적용 됩니다.

Introduction

유전자 규칙 생물학에 있는 중요 한 역할을 한다. 유전자의 전사 사전 mRNA 접합, 3′ 끝, RNA 수출, 번역, mRNA 지 방화, 붕괴, 포스트 번역 상 수정/안정성, 등 모두 DNA과 RNA 의무적인 단백질 유전자에 핵심 역할 수준에서 통제 될 수 있다 규칙입니다. 수많은 규제 단백질 식별 분자 유전 분석, 하는 동안 그들의 작은 하위 집합만 그들의 세포질 기능 또는 바인딩 사이트 비보완전히 특징 되어 있다. 계통 발생 시퀀스 분석과 mutagenesis DNA 또는 RNA 단백질 상호 작용의 특성을 상호 보완적인 접근을 제공 합니다.

RNA-바인딩 단백질은 성적인 감 별 법을 포함 하 여 개발 프로세스에서 중요 한. 섹스-치명적인 (SXL) 초파리 단백질 또는 마스터 섹스-스위치 단백질은 결 석 남성, 여성에서 현재에. Uridine-풍부한 시퀀스 또는 pyrimidine 책자 다운스트림 사전 mRNA 목표 (변압기, 치명적이 지 섹스, 남성 전용 lethal2) 체세포^{1,2에서에서 특정 스플라이스 사이트에 인접 한 인식 ,,34}. 또한, 그것은 기초의 증강 (e(r)) 사본^5,6uridine 풍부한 polyadenylation 증강 시퀀스에 바인딩하여 스위칭 polyadenylation 사이트 조절. SXL 가능성이 조절 되도록 남아 있는 여성 생식에 추가 대상 확인^{1,7,,89,,1011, 12 , 13}.

일반적으로, 바인딩 사이트의 특성을 포함 한다 mutagenesis를, 예를 들어 삭제 또는 단일 또는 여러 개의 뉴클레오티드의 대체. 야생-타입 RNA 순서를 기준으로 각 돌연변이 바인딩 사이트 다음 바인딩 선호도 결정 하기 위해 일련의 단백질 농도 사용 하 여 분석 (K_d 또는 평형 분리 상수); 관심사의 단백질에 대 한 K_d 50 %RNA 바인딩을 얻을 하는 데 필요한 단백질 농도 이다. 자세한 mutagenesis의이 노동 집약적인 과정 포함 세대 및 수많은 돌연변이의 분석-3 야생 타입 뉴클레오티드 바인딩 사이트에 있는 각 위치에 대 한. 따라서, RNA에 단백질 의무 사이트의 빠르고, 쉽고, 저렴 한 포화 mutagenesis에 대 한 다른 접근 방법에 대 한 필요가 있다.

여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis 있도록 단계 접근 방식을 설명 합니다. 그것은 사이트 내에서 바인딩, 각 phosphorothioate 뉴클레오티드와 별도 RNAs의 합성 및 단백질 외피 다음 바인딩된 분수의 절연 야생-타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 포함. 야생-타입 뉴클레오티드에서 간섭 결과 단백질 바인딩 부분에서 그들의 특혜 배제. 이 다음의 phosphodiester phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis 또는 PTM)를 포함 하는 요오드와 선택적 화학 분열 하는 젤 전기 이동 법에 의해 모니터링 됩니다. 이 단일 단계 포화 mutagenesis 접근 RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 특성에 적용 됩니다.

Protocol

참고: 그림 1 phosphorothioate mutagenesis에 대 한 개요를 제공 하 고 프로세스의 주요 단계를 요약. 1. 돌연변이 체의 도서관의 세대-야생 타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 T7 뇌관 종합 (5′-GTAATACGACTCACTATAG-3′) 화학 합성 DNA 합성기에 의해. 화학 합성 단백질 바인딩 사이트에 해당 하는 DNA 합성기에 의해도 핑된 oligonucleotide (보완 가닥) 음성 합?…

Representative Results

도 핑을 사용 하 여 포화 mutagenesis의 원리: 야생-타입 및 다른 뉴클레오티드의 적절 한 어 금 니 비율을 분석 하는 것입니다 한 위치 하는 경우에 모든 4 개의 뉴클레오티드의 동등한 혼합물을 사용 합니다. 그러나, 그러므로 동시에 여러 위치를 분석 비율의 비-야생 타입 야생-타입 뉴클레오티드를 조정 해야 합니다, 즉, 감?…

Discussion

Mutagenesis은 긴 단백질 바인딩 사이트 특성에 사용 되었습니다. 첫째, 돌연변이의 시리즈 구성 하 고 바인딩 바인딩 선호도에 미치는 영향을 분석 하는 분석에서 개별적으로 테스트 될 수 있습니다. 기준이 mutagenesis 접근 여러 시퀀스를 분석 하는 방법을 제공 하는 동안 여러 단계 돌연변이 구성 하 고 바인딩 각 돌연변이 대 한 반응의 일련과 같은 표준 접근에, 힘들고 시간이 걸리는 이며 하지 않을…

Materials

Uridine 5’ a-thio triphosphate	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-017
Adenosine 5’ a-thio triphosphate	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-016
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
Dephosphorlyation Kit	NEB	M0508
T4 Polynucleotide Kinase	NEB	M0201S
Proteinase K	NEB	P8107S
T7 RNA polymerase	NEB	M0251S
RNasin	Promega		RNase inhibitor
Glass Plates	Standard	Standard
Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
X-ray films	Standard	Standard
Polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard