Den replika sæt metode: En høj overførselshastighed tilgang til kvantitativt foranstaltning Caenorhabditis elegans levetid
Summary
Her beskrive vi metoden replikasæt, en tilgang til kvantitativt foranstaltning C. elegans levetid/overlevelse og healthspan i en høj overførselshastighed og robust måde, således at screening af mange betingelser uden at ofre datakvalitet. Denne protokol beskriver strategien og giver et software-værktøj til analyse af replikasæt data.
Abstract
Metoden replikasættet er en metode til at måle kvantitativt levetid eller overlevelse af Caenorhabditis elegans nematoder i en høj overførselshastighed måde, således at en enkelt investigator til skærmen flere behandlinger eller betingelser over den samme mængde gang uden tab af datakvalitet. Metoden kræver fælles udstyr findes i de fleste laboratorier, der arbejder med C. elegans og er således nemt at vedtage. Tilgangen er centreret om boltpistoler uafhængige prøver af en befolkning på hver observationspunkt og ikke en enkelt prøve over tid som med traditionelle langsgående metoder. Scoring indebærer tilføjer væske brønde i en multi godt plade, som stimulerer C. elegans til at flytte og letter kvantificere ændringer i healthspan. Andre store fordele ved metoden replikasæt omfatter reduceret eksponering af agar overflader til luftbårne forurenende stoffer (fx mug eller svamp), minimal håndtering af dyr og robusthed til sporadisk mis scoring (f.eks. kræver et dyr som dødt, når det er stadig i live). Passende analysere og visualisere data fra et replikasæt stil eksperiment, blev en brugerdefineret softwareværktøj også udviklet. Nuværende funktioner af software omfatter plotning af overlevelse kurver for såvel replikasæt og traditionelle (Kaplan-Meier) eksperimenter, som statistisk analyse for replikasæt. De protokoller findes her beskrive de traditionelle eksperimenterende tilgang og metoden replikasæt, samt en oversigt over de tilsvarende dataanalyse.
Introduction
En af de mest transformative teknologiske fremskridt mod forståelse det genetiske grundlag for aging var udviklingen af fodring-baserede RNAi i C. elegans1; inden det eksperimentelle brug af RNAi var mange fænotyper af befolkningens aldring ikke genetisk tractable. Fodring-baserede RNAi er opnået gennem produktionen af dsRNA inden for E. coli , der svarer til en endogene C. elegans mRNA: IPTG inducerer tovejs transskription på tværs af et indstik af enten C. elegans cDNA eller en del af en Åbn læsning ramme inden for en plasmid2. Når C. elegans foder på intakt er E. coli, dsRNA produceres af bakterier transporteret fra lumen i tarmcellerne via SID-2 transmembrane protein3, og derefter distribueres gennem resten af dyret via SID-14. Inden for hver celle, eksogene dsRNA er forarbejdet af Dicer komplekse til siRNA, som interagerer med et modent mRNA via supplerende base parring til at oprette en ny siRNA-mRNA duplex. Denne duplex er anerkendt af RISC-komplekset og kløvet, dermed forringe den endogene mRNA5. Således, ved blot at ændre plasmidet indsætte, kan en Deaktiver funktionen af næsten enhver gen inden for C. elegans genom. Denne opdagelse førte til oprettelsen af flere store fodring-baserede RNAi biblioteker-samlinger af omdannet E. coli bestande, der kan kombineres for at opnå dækning af ca. 86% af kendt C. elegans gener6, 7.
Siden fremme af fodring-baserede RNAi, har omfattende skærme i C. elegans ført til opdagelsen af mere end 900 gener, der ændrer levetid når inaktiveret (som det fremgår af RNAi-fænotype foreninger kurateret i WormBase), som vi kalder at som gerogenes. En rolle for størstedelen af gerogenes i levetiden kontrol blev opdaget gennem fodring-baserede RNAi i et par skelsættende rapporter (Se figur 1A og supplerende fil 1 for detaljer). I nogle tilfælde, har disse gerogenes identificeret baseret på måling levedygtighed på en enkelt eller et par tidspunkter, som undlader at give et kvantificerbare mål for ændringer i levetid med RNAi behandling. I andre tilfælde er disse gener vurderet kvantitativt for ændringer i levetid, samt yderligere alder-associerede fænotyper. For eksempel, identificerede vi tidligere 159 gener, der var nødvendige for både normale og øget levetid af dyr med nedsat insulin/IGF-1 signaling, og målbare ændringer i healthspan. Af disse medføre 103 gen inactivations en progeric fænotype, som tab resulterede i et eller flere tegn på for tidlig aldring8.
Mens nogle gerogenes har været forbundet med 100 eller flere undersøgelser (fx daf-16, daf-2, sir-2.1), har over 400 gerogenes 10 eller færre citater (figur 1B, og supplerende fil 2). Således, mens omfattende fodring-baserede RNAi skærme har opdaget og flygtigt karakteriseret hundredvis af formodede gerogenes, hvordan disse gener funktion i levetiden kontrol, og de genetiske indbyrdes forbindelser mellem disse genprodukter forbliver dårligt studerede. Fuld langsgående analyse for alder-associerede fænotyper er en forudsætning for at identificere genetiske interaktioner mellem gerogenes (f.eks. epistatic interaktioner, asynthetic interaktioner, etc.). At få dybere indsigt i de genetiske samspillet mellem gerogenes kræver en høj overførselshastighed kvantitativ metode, som også udnytter fordelene ved fodring-baserede RNAi.
Den mest almindelige surrogat foranstaltning af befolkningens aldring er levetid. Den traditionelle tilgang til måling af C. elegans dødelighed spor dødsfald af enkelte dyr over tid i en lille population stikprøve. Et relativt lille antal dyr, der er fulgt med tiden og med jævne mellemrum er forsigtigt prodded med enten platin tråd eller øjenvipper med bevægelse som en indikator for levedygtighed (figur 2A). Denne metode har været almindeligt anvendt, da det giver enkel, direkte målinger af gennemsnitlige og den maksimale levetid. Men denne traditionelle metode er tidskrævende og relativt lav-overførselshastighed, der begrænser antallet af dyr og betingelser, der samtidig kan måles på en kontrolleret måde. En nylig simulation undersøgelse konstateret, at mange C. elegans levetid undersøgelser ikke assay et stort nok antal dyr at pålideligt registrere små ændringer mellem betingelser9. Denne traditionelle metode indebærer desuden gentagne gange håndtering af samme kohorte af dyr over tid, hvilket igen kan introducere forurening, og kan beskadige eller dræbe stadig skrøbelige, alderen dyr.
Vi har udviklet en alternativ “replikasæt” metode til måling af C. elegans levetid. Med henblik herpå, en stor population af alder-synkroniseret, isogene dyr er opdelt i en række små populationer (eller kopier). Nok replika prøver er genereret for at dække hvert tidspunkt i det planlagte forsøg. For hver observation tidspunkt, en af replikaerne er scoret for antallet af levende døde og censureret dyr, så dyr inden for at kopiere er kasseret. Således over den forventede levetid af befolkningen som helhed, en række uafhængige delpopulationer er periodisk stikprøven (figur 2B). I ved hjælp af replikasæt er der ingen gentagne prodding af dyr og ikke gentagen udsættelse for potentielle miljømæssige forurening. Levedygtighed observeret på engangs punkt er helt uafhængig af alle andre observation, hvilket minimerer håndtering og øger gennemløb af mindst en størrelsesorden. Dette har tilladt os at kvantificere ændringer i levetiden for hundredvis af RNAi kloner samtidig8,10.
Her præsenterer vi detaljerede protokoller for udførelse af C. elegans levetid via både replikasæt og traditionelle metoder for scoring C. elegans levetid. Vi demonstrere, at lignende resultater er opnået mellem metoderne. Vi har udviklet software til at hjælpe med den grafiske analyse af levetid data genereret gennem enten tilgang, som vi frit give under GPL V3 licens (Se tabel af materialer). “WormLife” er skrevet i R11, og indeholder en grafisk brugergrænseflade (GUI) til afbilde data, som er blevet testet i Mac OS og Linux. Endelig, vi sammenligne og kontrast begrænsninger af hver metode og fremhæve andre overvejelser, når du vælger mellem tilgange til at måle kvantitative ændringer i C. elegans levetid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både de traditionelle og replika sæt metoder kræver synkronisering af kronologisk alderen dyr. Vi inkluderer en metode, der synkroniserer dyr ved hjælp af hypokloritiske behandling af fælderne voksne, hvor kun befrugtede æg med den fælderne voksne overleve behandling. Disse embryoner klækkes i flydende suspension og udviklingshæmmede anholdt på den første larve stadie (L1). Efter såning L1 dyr på mad (fx E. coli udtrykker dsRNA et gen af interesse), genoptage dyr udvikling. Synkronisering L…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen af dette arbejde, der er beskrevet i dette manuskript blev leveret af: University of Rochester Office af The Provst og School of Medicine og tandpleje Dekansekretariatet via Health Sciences Center for Computational Innovation (HSCCI); de Ellison medicinsk Foundation nye lærde i Aging Fellowship (AG-NS-0681-10) finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Referências
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
- Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
- Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
- Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2018)
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Biologia do Desenvolvimento. 51 (1), 23-33 (1976).
- Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
- Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
- Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
- Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
- Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genética. 139 (4), 1567-1583 (1995).
- Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
- Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
- Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genética. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
- Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
