השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים
Summary
כאן נתאר שיטת עותקים משוכפלים, גישה באופן כמותי מודדים C. elegans תוחלת החיים/הישרדות, healthspan באופן תפוקה גבוהה וחזק, ובכך לאפשר הקרנה של מצבים רבים מבלי להתפשר על איכות הנתונים. פרוטוקול זה מפרט את האסטרטגיה, ומספק כלי תוכנה לניתוח של נתונים המשוכפלים.
Abstract
השיטה העותקים המשוכפלים היא גישה למדוד באופן כמותי תוחלת החיים או ההישרדות של נמטודות Caenorhabditis elegans באופן תפוקה גבוהה, ובכך מאפשר חוקר יחיד למסך טיפולים או תנאים נוספים על אותה כמות של זמן ללא אובדן של איכות הנתונים. השיטה דורשת ציוד נפוץ נמצאו רוב מעבדות עובד עם C. elegans , והוא לכן פשוט לאמץ. הגישה מתמקדת assaying דגימות עצמאית של אוכלוסיה בכל נקודה תצפית, ולא דוגמה אחת לאורך זמן כמו עם שיטות מסורתיות האורך. אשר הניקוד כרוך הוספת נוזל הבארות של צלחת רב טוב, מעורר C. elegans לעבור ומקל לכימות לשינויים healthspan. היתרונות העיקריים האחרים של השיטה העותקים המשוכפלים כוללים חשיפה מופחתת של אגר משטחים כדי מזהמים הנישאים באוויר (למשל עובש או פטריות), מינימלי טיפול בעלי חיים, ועמידות סדיר בזיהוי שגיאות ניקוד (כגון קוראים חיה למתה זה עדיין בחיים). כדי כראוי לנתח והמחש את הנתונים מתוך ניסוי סגנון עותקים משוכפלים, פותחה גם כלי תוכנה מותאמת אישית. ליכולות הנוכחיות של התוכנה כוללים התוויית של עקומות הישרדות הן עותקים משוכפלים ואת הניסויים (קפלן-מאייר) המסורתי, כמו גם ניתוח סטטיסטי עבור עותקים משוכפלים. הפרוטוקולים שסופק כאן לתאר ניסיוני הגישה המסורתית בשיטת עותקים משוכפלים, כמו גם סקירה של ניתוח הנתונים המתאימים.
Introduction
אחד הפיתוחים הטכנולוגיים טרנספורמטיבי ביותר להבנת בסיס גנטי של הזדקנות היה הפיתוח של האכלה מבוססי RNAi ב- C. elegans1; לפני שימוש ניסיוני RNAi, פנוטיפים רבים של הזדקנות לא היו גנטית צייתן. RNAi האכלה מבוססי מושגת דרך יצירת dsRNA בתוך החיידק המתאים אנדוגני C. elegans mRNA: IPTG גורם שעתוק דו-כיווני מעבר מוסף של cDNA C. elegans או או חלק מסגרת קריאה פתוחה בתוך פלסמיד2. כאשר C. elegans להאכיל על ללא פגע dsRNA e. coli, מיוצר על ידי חיידקים מועבר מן לומן לתאי המעי באמצעות חלבון טראנסממברנלי סיד-23, הופצו בין שאר החיות באמצעות סיד-14. בתוך כל תא, dsRNA אקסוגני יעובד על-ידי לטעמים מורכבים לתוך siRNA, אשר אינטראקציה עם mRNA בוגר דרך זיווג הבסיס משלימים ליצירת חדש דופלקס siRNA-mRNA. דופלקס זה מזוהה על-ידי המתחם RISC, ביקע, ובכך משפילים את ה-mRNA אנדוגני5. לפיכך, על ידי, רק לשנות את תותב פלסמיד אחד יכול להשבית את הפונקציה של כמעט כל הגנים בתוך הגנום C. elegans . תגלית זו הובילה ליצירת מספר גדול RNAi האכלה מבוסס ספריות-אוספים של טרנספורמציה מניות e. coli שניתן לשלב כדי להשיג כיסוי של-86% ידוע C. elegans גנים6, 7.
מאז לקידום האכלה מבוססי RNAi, מסכי מקיף C . elegans הובילו גילוי גנים למעלה מ-900 לשנות תוחלת כאשר לא פעיל (כפי שמעידים השיוכים RNAi-פנוטיפ מספר פעמים ב- WormBase), שאותם אנו מכנים כדי כמו gerogenes. תפקיד עבור הרוב המכריע של gerogenes בשליטה אריכות ימים התגלה באמצעות האכלה מבוססי RNAi בדוחות הזרע ספורות (ראה איור 1A ו- 1 קובץ משלים לפרטים). במקרים מסוימים, gerogenes אלה זוהו מבוסס על מדידת הכדאיות בודד או מספר נקודות זמן, נכשל לספק מידה הניתנת לכימות של שינוי תוחלת חיים עם טיפול RNAi. במקרים אחרים, הגנים האלה היה להעריך באופן כמותי לקראת שינויים תוחלת חיים, וכן פנוטיפים נוספים הקשורים לגיל. למשל, בעבר זוהו גנים 159 היו נחוצים עבור תוחלת החיים הרגילה והן מוגברת של חיות עם איתות אינסולין/IGF-1 ירידה ולאחר לכמת את השינויים ב- healthspan. אלה, 103 ג’ין inactivations לגרום הפנוטיפ progeric, כמו אובדן, גרמו סימני הזדקנות מוקדמת8אחד או יותר.
בעוד כמה gerogenes קושרו עם 100 או יותר מחקרים (למשל הדף היומי-16, הדף היומי-2, אדוני-2.1), gerogenes מעל 400 יש אזכורים 10 או פחות (איור 1B, ו -2 קובץ משלים). לכן, בעוד מסכי RNAi האכלה מבוססי מקיף גילה ואתה cursorily מאופיין מאות בשם gerogenes, איך פונקציה גנים בשליטה אריכות ימים, את קשרי הגומלין גנטי בין מוצרים אלה ג’ין נותרו לקוי למד. ניתוח מלא האורך של גיל-הקשורים פנוטיפים הוא תנאי הכרחי לזיהוי גנטי האינטראקציות בין gerogenes (למשל epistatic אינטראקציות, asynthetic אינטראקציות, וכו ‘.). צובר בתובנה עמוקה יותר יחסי הגומלין גנטי בין gerogenes דורש שיטה כמותית תפוקה גבוהה, אשר גם ממנף את היתרונות של האכלה מבוססי RNAi.
המדד הנפוץ ביותר הפונדקאית ההזדקנות היא תוחלת החיים. הגישה המסורתית למדידת C. elegans התמותה עוקב אחר מותם של חיות בודדות לאורך זמן בתוך מדגם אוכלוסיה קטנה. מספר קטן יחסית של בעלי חיים עוקבים לאורך זמן ו מעת לעת הינם בעדינות דחק עם חוט פלטינה או עפעף, עם תנועת כמחוון הכדאיות (איור 2 א). שיטה זו כבר בשימוש נרחב, כפי שהיא מספקת מדידות פשוטה, ישירה של הממוצע ואת תוחלת החיים המירבי. שיטה מסורתית זו זאת, זמן רב, יחסית תפוקה נמוכה, אשר מגביל את מספר בעלי החיים ואת התנאים שבהם ניתן למדוד בו זמנית בצורה מבוקרת. מחקר הדמיה שנערך לאחרונה מצא כי מחקרים רבים של תוחלת החיים המוטנטיות לא assay מספר מספיק גדול של בעלי חיים כדי להיות מסוגלים לזהות שינויים קטנים בין התנאים9בצורה אמינה. יתר על כן, שיטה מסורתית זו כרוכה שוב ושוב טיפול באותה קבוצה של בעלי חיים לאורך זמן, אשר בתורו יכול להציג זיהום, ואני יכול לפגוע או להרוג בעלי חיים שברירית יותר ויותר, בגילאי.
פיתחנו מתודולוגיה אלטרנטיבית “העותקים המשוכפלים” למדידת אורך C. elegans . לשם כך, אוכלוסיה גדולה של בעלי חיים גיל-מסונכרנות, isogenic מחולקים מספר אוכלוסיות קטנות (או העתקים). מספיק דוגמאות משוכפל נוצרים כדי לכסות את נקודת זמן הניסוי המתוכנן. בכל נקודה בזמן התבוננות, באחד העותקים המשוכפלים הוא הבקיע עבור מספר חי, מת, החיות מצונזרים, אז חיות בתוך זה שכפול יימחקו. לכן, מעל תוחלת החיים הצפויה של האוכלוסייה בכללותה, סדרה של subpopulations עצמאית הן מעת לעת לטעום (איור 2B). באמצעות המשוכפלים יש לא לדרבן חוזרות ונשנות של בעלי חיים, אין חשיפה חוזרת ונשנית פוטנציאל זיהום סביבתי. הכדאיות שנצפה בנקודה חד פעמי הוא עצמאי לחלוטין כל התבוננות אחרים, אשר מצמצם את הטיפול, מגדיל את התפוקה על-ידי לפחות בסדר גודל. זו אפשרה לנו quantitate לשינויים תוחלת החיים עבור מאות RNAi שיבוטים בו זמנית8,10.
כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורט עבור ניצוח C. elegans תוחלת החיים באמצעות עותקים משוכפלים והן שיטות מסורתיות עבור ניקוד C. elegans אריכות ימים. נדגים כי תוצאות דומות מתקבלים בין השיטות. יש לנו התוכנות שפותחו כדי לסייע בניתוח הגרפי של תוחלת החיים נתונים שנוצרו באמצעות גם גישה, אשר אנו מספקים באופן חופשי תחת רישיון GPL V3 (ראו טבלה של חומרים). “WormLife” נכתב ב- R11, כולל ממשק משתמש גרפי (GUI) עבור התוויית נתונים, אשר נבדקו ב- Mac OS ו- Linux. לבסוף, אנחנו להשוות ניגודיות המגבלות של כל שיטה, לסמן שיקולים נוספים בבחירת בין גישות למדידת שינויים כמותיים ב- C. elegans תוחלת החיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שתי מסורתיים, עותק משוכפל קבע השיטות מחייבות את הסינכרון של בעלי חיים גיל כרונולוגי. אנו כוללים שיטה המסנכרנת בעלי החיים באמצעות טיפול תת-כלורי מבוגרים gravid, שבו רק הביצים עם המבוגר gravid לשרוד טיפול. אלה העוברים בוקעות ההשעיה נוזלי, מבחינת לעצור בשלב הזחל הראשון (L1). לאחר זריעה L1 חיות על גבי מ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון עבור עבודה זו המתוארת בכתב יד זה נמסר על ידי: המשרד אוניברסיטת רוצ’סטר של פרווסט, בית הספר לרפואה, רפואת שיניים ומבחנים באמצעות מרכז מדעי הבריאות עבור חישובית חדשנות (HSCCI); אליסון רפואי קרן חדשה חכמי הדת מלגת הזדקנות (AG-NS-0681-10) התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Referências
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
- Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
- Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
- Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2018)
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Biologia do Desenvolvimento. 51 (1), 23-33 (1976).
- Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
- Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
- Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
- Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
- Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genética. 139 (4), 1567-1583 (1995).
- Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
- Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
- Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genética. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
- Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
